酒精對人臍靜脈間充質干細胞治療腎虛血瘀型骨質疏松癥大鼠的影響＊

呂航 李小冬 劉宏鵬 王順 宿慧

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是骨密度及骨質量降低，骨微結構發生破壞的一種疾病[1]。酒精對骨密度和骨量存在較大影響[2]；酒精能對骨組織的異常代謝進行誘導，對成骨-破骨平衡進行破壞[3]。但目前尚未清楚酒精作用在哪個階段來影響BMSCs抑成骨/促成脂分化的能力。祖國醫學認為，酒精性骨質疏松癥，以腎虛血瘀為主要病機，以補腎活血法主之[4]。人臍靜脈間充質干細胞（human umbilical vein mesenchymal stem cells，hUV-MSCs）來源豐富，具有減輕和消除炎癥、修復組織損傷等多種生物學功能，已越來越多地應用于器官損傷的治療[5]。以往研究顯示酒精對腎虛血瘀型OP的治療有消極作用[6]，但關于酒精對hUV-MSCs治療腎虛血瘀型OP分子機制方面的研究少見。基于此本研究將通過動物實驗對此進行探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康4周齡SD雄性大鼠40只，大鼠重量240～260 g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（黑）2019-0004。

1.2 試劑、設備與細胞株

試劑：75%醫用酒精（生產廠家：山東朱氏藥業集團有限公司，批準文號：魯衛消證字2015第1603號，配置為20%濃度）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）ELISA檢測試劑盒均購自北京博奧派克生物科技有限公司。

儀器：酶標儀（生產廠家：上海賽默科技生物發展有限公司，型號：DP-6100）；-80 ℃超低溫冰箱（生產廠家：日本SANYO三洋電機，型號：MDF-C8V）；光學顯微鏡（生產廠家：日本奧林巴斯，型號：STT-300）；熒光顯微鏡（生產廠家：日本奧林巴斯，型號：LF50）；臺式高速冷凍離心機（生產廠家：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H2050R）。

細胞株：人臍帶間充質干細胞hUV-MSCs，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.3 動物造模及分組

采用酒精腹腔注射法制備腎虛血瘀型OP大鼠模型，造模成功后將SD大鼠隨機分為酒精組、治療組和對照組，每組10只。酒精組尾靜脈注射酒精 [20%，10 ml/（kg·次），1次 /周 ]，對照組在酒精組基礎上尾靜脈注射hUV-MSCs（1次/周，107個細胞/次），治療組停止酒精注射但尾靜脈注射注射 hUV-MSCs（1次 /周，107個細胞 /次）；取SD大鼠10只腹腔注射法生理鹽水作為假手術組，尾靜脈注射生理鹽水 [10 ml/（kg·次），1次 /周 ]。四組均連續治療8周。

1.4 觀察指標

處死大鼠后，取大鼠腰椎骨進行以下檢測：（1）采用HE染色對大鼠骨組織的病理損傷情況進行檢測，觀察骨小梁面積變化。（2）采用TUNEL染色檢測觀察骨組織細胞凋亡情況，熒光顯微鏡觀察FITC標記的TUNEL陽性細胞并拍照。（3）采用醫學顯微CT檢測骨組織的骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁分離距離（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）。（4）采用 ELISA 檢測血清ALP和TRAP水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組骨組織病理損傷的比較

假手術組、酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積分別為（71.25±3.64）%、（38.19±2.57）%、（52.10±2.76）%、（56.31±2.90）%，四組大鼠骨組織骨小梁面積比較，差異有統計學意義（F=206.5，P＜0.05）。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積均小于假手術組（P＜0.05），治療組與對照組大鼠骨組織骨小梁面積均大于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨組織骨小梁面積大于對照組（P＜0.05）。四組大鼠骨組織病理學HE染色情況，見圖1。

圖1 四組大鼠骨組織病理學HE染色情況（×100）

2.2 四組骨組織細胞凋亡情況比較

假手術組、酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織 TUNEL陽性細胞數分別為（5.16±1.08）、（36.29±2.43）、（27.18±2.05）、（24.71±2.36），四組比較大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數比較，差異有統計學意義（F=407.5，P＜0.05）。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數均多于假手術組（P＜0.05），治療組與對照組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數均少于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數明顯少于對照組（P＜0.05）。四組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞熒光顯色圖片，見圖2。

圖2 四組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞熒光顯色圖片（×200）

2.3 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較

四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均低于假手術組（P＜0.05），Tb.Sp均高于假手術組（P＜0.05）；治療組與對照組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均高于酒精組（P＜0.05），Tb.Sp均低于酒精組（P＜0.05）；治療組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均高于對照組（P＜0.05），Tb.Sp低于對照組（P＜0.05），見表 1。

表1 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較（±s）

表1 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較（±s）

*與假手術組比較，P＜0.05；#與酒精組比較，P＜0.05；△與對照組比較，P＜0.05。

組別 BVF（%） Tb.Th（mm） Tb.Sp（mm）假手術組（n=10） 31.60±2.98 0.079±0.003 0.13±0.04酒精組（n=10） 8.42±1.05* 0.034±0.002* 0.65±0.07*對照組（n=10） 17.53±2.14*# 0.048±0.005*# 0.54±0.06*#治療組（n=10） 20.90±2.36*#△ 0.060±0.007*#△ 0.26±0.03*#△F值 175.8 167.2 235.0 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 四組血清ALP和TRAP水平比較

四組血清ALP與TRAP水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。酒精組、對照組、治療組大鼠血清ALP與TRAP水平均高于假手術組（P＜0.05），治療組與對照組大鼠血清ALP與TRAP水平均低于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨血清ALP與TRAP水平均低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 四組血清ALP和TRAP水平比較（±s）

表2 四組血清ALP和TRAP水平比較（±s）

*與假手術組比較，P＜0.05；#與酒精組比較，P＜0.05；△與對照組比較，P＜0.05。

組別 ALP（U/L） TRAP（pg/ml）假手術組（n=10） 17.36±2.48 14.30±1.69酒精組（n=10） 60.17±3.95* 35.72±3.68*對照組（n=10） 41.60±2.72*# 26.47±2.16*#治療組（n=10） 33.80±2.49*# △ 21.05±2.24*# △F值 357.5 125.6 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

酒精性OP是繼發性OP，是指因人體長期大量飲酒引起骨量丟失，骨微觀結構退化致使骨脆性增加的一種全身性骨骼疾病[6]。長期慢性飲酒可致多種疾病發生，酒精可干擾骨代謝，損害骨骼系統引起骨質疏松，導致骨折，為家庭帶來沉重經濟負擔[7]。hUV-MSC能分化成為中胚層間質組織，具備自我更新及多向分化的潛能。hUV-MSCs來源豐富、取材操作方便、不涉及倫理學問題，能促進成骨細胞的增殖活性[8]。國外學者通過構建骨質疏松性下頜骨壞死大鼠模型，探討臍帶間充質干細胞的治療效果，結果顯示骨質疏松性下頜骨壞死大鼠骨再生明顯增強，成骨細胞數量增高[9]。

以往有研究顯示，長期酒精攝入可導致大鼠骨小梁數量減少、間隙增大、厚度降低，使骨骼彈性模量、最大載荷及破壞載荷等生物力學性能降低，骨骼抵抗外力性能下降，骨折風險明顯增加[10]；還有研究顯示，酒精可誘導骨髓間充質干細胞ROS水平及自噬水平升高，抑制成骨而促進成脂分化[11]。本研究結果顯示，酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均低于假手術組，骨組織TUNEL陽性細胞數、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均高于假手術組（P＜0.05）；治療組與對照組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均高于酒精組，骨組織TUNEL陽性細胞數、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于酒精組（P＜0.05）；治療組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均高于對照組，骨組織TUNEL陽性細胞數、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于對照組（P＜0.05）。提示酒精對hUV-MSCs治療OP大鼠有消極的影響。ALP是堿性磷酸的一種同工酶，由成骨細胞產生，是成骨細胞成熟和具有活性的標志，對了解成骨細胞的狀態有重要意義。隨著OP病情的進展ALP水平逐漸升高，表明其與骨質疏松有密切的關系[12-13]。TRAP過度表達的大鼠模型表現為骨質疏松。骨吸收時，破骨細胞附著在骨的表面，分泌的酸和蛋白酶在骨基質與破骨細胞之間形成一個空隙，磷酸酐酶和H+-ATP酶質子泵形成一個酸性環境，位于破骨細胞微粒體TRAP，即通過破骨細胞波狀緣分泌進入此空隙，與其他酶一起參與骨基質中固體鈣磷礦化物的降解[14-15]。

綜上所述，酒精影響hUV-MSCs成骨/成脂分化平衡，進而影響了其在腎虛血瘀型OP中的治療效果。