豬德爾塔冠狀病毒致病機理及防治研究進展

胡湘云，潘鵬丞，吳倍儀，陳寶劍，覃兆鮮，謝炳坤

(廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，南寧 530001)

豬德爾塔冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)可引起豬嘔吐、水樣腹瀉、脫水甚至死亡，常與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)等腸道冠狀病毒存在混合感染[1]。自2014年首次在美國暴發(fā)以來，先后在全球多個國家都檢測到PDCoV，目前已呈現(xiàn)全球性流行趨勢，嚴重沖擊了養(yǎng)豬業(yè)的有序發(fā)展[2]。相關(guān)報道顯示，PDCoV還可跨物種感染雞、牛[3-4]。2021年，研究人員在3名患有急性未分化發(fā)熱性疾病的海地兒童血漿樣品中檢測到PDCoV，這是首次在人類中發(fā)現(xiàn)該病毒，其快速傳播和潛在的跨物種傳播特性，給動物和人類健康安全帶來了巨大威脅[5]。由于PDCoV致病機制尚未探明，缺乏疫苗和特效藥物，已成為當前養(yǎng)豬業(yè)疫病防控難點。筆者將從PDCoV的編碼蛋白功能、致病機理、診斷方法、疫苗開發(fā)及抗病毒治療所取得的進展進行梳理和闡述，以期加強對PDCoV的全面了解，為安全高效疫苗和防治藥物的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 PDCoV編碼蛋白及功能

PDCoV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長25 400 nt，PDCoV可編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：棘突蛋白(spike，S)、膜蛋白(membrane，M)、包膜蛋白(envelope，E)和核衣殼蛋白(nucleocapsid，N)，15個非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，nsp)和3個輔助蛋白(NS6、NS7和NS7a)。其中S、E和M蛋白是囊膜蛋白,N蛋白構(gòu)成病毒核衣殼，非結(jié)構(gòu)蛋白與病毒RNA合成有關(guān),輔助蛋白雖不是病毒增殖的必需蛋白但其能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，PDCoV編碼蛋白的具體結(jié)構(gòu)特征和功能見表1。

表1 PDCoV編碼蛋白及功能Table 1 PDCoV encoding proteins and their functions

續(xù)表

2 PDCoV致病機理

PDCoV侵入宿主體內(nèi)并引起發(fā)病是復雜的多種機制共同作用的過程，其通過與宿主細胞膜上受體結(jié)合侵入細胞，以頡頏IFN反應(yīng)、誘導細胞凋亡、調(diào)控細胞自噬、抑制細胞焦亡等途徑逃避宿主免疫應(yīng)答以維持自身增殖，同時還有細胞分子和宿主蛋白共同參與致病過程。

2.1 侵入細胞的受體和途徑

研究發(fā)現(xiàn)，豬氨基肽酶N (porcine aminopeptidase N，pAPN)是PDCoV侵入細胞的受體，PDCoV通過S1亞基C-端結(jié)構(gòu)域(carboxy-terminal domain,CTD)與pAPN的種間保守結(jié)構(gòu)域Ⅱ結(jié)合感染豬、雞和人類等細胞，且該受體通過內(nèi)吞途徑促進PDCoV侵入細胞并完成復制[23-24]。然而，特異性抑制pAPN的表達不能完全阻斷PDCoV感染豬上皮細胞(IPI-2I)，說明PDCoV還可能使用其他受體侵入細胞[25]。隨后，唾液酸(sialic acid,SA)被證實也是PDCoV的結(jié)合受體，SA參與PDCoV S1亞基的受體結(jié)合與病毒中和作用，且S1亞基的domain A(即NTD或S1A)與SA互作有關(guān)，PDCoV利用SA作為侵入細胞的受體的結(jié)合能力受胰蛋白酶影響[26-27]。研究發(fā)現(xiàn),PDCoV還能通過巨胞飲作用(不需要特定受體)和網(wǎng)格蛋白(需低pH環(huán)境和動力蛋白)介導的內(nèi)吞作用進入豬回腸上皮細胞，通過小窩介導的內(nèi)吞途徑進入豬睪丸細胞(ST)和豬腎細胞 (LLC-PK1)[28]。

2.2 逃避宿主免疫應(yīng)答

宿主天然免疫系統(tǒng)是抵抗病毒感染的第一道防線，通過IFN途徑、細胞凋亡、細胞自噬和細胞焦亡發(fā)揮抗病毒作用，諸多研究發(fā)現(xiàn)PDCoV已發(fā)展出多種免疫逃避機制來逃避宿主免疫應(yīng)答。

2.2.1 頡頏IFN反應(yīng) IFN在宿主先天免疫應(yīng)答中起著重要作用，其大量表達能幫助宿主頡頏病毒感染，PDCoV的多個結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白均通過各種策略頡頏宿主IFN反應(yīng)，抑制IFN表達，逃避宿主先天免疫應(yīng)答,PDCoV頡頏IFN反應(yīng)的作用機制見圖1。

N蛋白結(jié)合視黃酸誘導基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)阻礙后者識別雙鏈RNA，還能破壞RIG-Ⅰ激活劑(Riplet)和雙鏈RNA激活的蛋白激酶激活劑(double stranded RNA activated protein kinase-activating protein,PACT)結(jié)合RIG-Ⅰ來抑制RIG-Ⅰ K63連接的多泛素化，此外，它通過泛素-蛋白酶途徑促進干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)降解，利用多種途徑抑制IFN-Ⅰ的生成[13,14,29]。

nsp5蛋白通過切割核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)必需調(diào)節(jié)劑——NEMO分子并降低其表達量，阻礙IFN生成；它還可通過裂解Janus激酶信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活劑(Janus tyrosine kinase-signal transducer and activator of transcription 1，JAK/STAT)信號通路中的關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)錄激活因子2(signal transducer and activator of transcription 2,STAT2)，抑制IFN下游信號分子的激活及抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄，從而頡頏天然免疫應(yīng)答[19]。nsp10則通過削弱2種轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和NF-κB p65亞基的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，抑制IFN-β產(chǎn)生，nsp14和nsp16具有協(xié)同作用，能增強nsp10對IFN-β的抑制作用[21]。nsp15蛋白通過不依賴內(nèi)切核糖核酸酶活性的機制破壞NF-κB活化來抑制IFN-β產(chǎn)生，但不頡頏IRF3的活化[22]。

NS6蛋白與RNA識別受體RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)互作降低受體對雙鏈RNA的識別，頡頏IFN-β產(chǎn)生[15]。NS7a通過同時與IKKε的激酶結(jié)構(gòu)域和支架二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TNF receptor associated factors，TRAF3)和IRF3競爭結(jié)合IκB激酶(IκB kinase ε，IKKε)，頡頏視黃酸誘導基因Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-like receptors，RLR)介導的IFN-β形成[17]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，PDCoV感染能減少過氧化物酶體(peroxisome)的數(shù)量進而抑制IFN-Ⅲ反應(yīng)，這能規(guī)避宿主的抗病毒免疫，但不影響IRF1和線粒體抗病毒信號(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)的表達水平[30]。

2.2.2 誘導細胞凋亡 細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，病毒感染宿主后發(fā)揮凋亡作用可促進病毒從感染細胞中釋放和傳播，誘導細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，PDCoV感染細胞通過凋亡效應(yīng)蛋白Bax募集或線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔打開來刺激線粒體外膜透化，導致線粒體中促凋亡分子細胞色素C(cytochrome C，Cyt c)釋放到細胞質(zhì)中，從而啟動caspase依賴的線粒體通路(內(nèi)源性細胞凋亡途徑)[32]。此外，通過檢測PDCoV感染的細胞中的caspase3、caspase8和caspase9的活性發(fā)現(xiàn)，其活性隨病毒感染性增多而提高，證明PDCoV可同時激活內(nèi)源性(線粒體途徑)與外源性(死亡受體通路)細胞凋亡通路，誘導細胞凋亡[33]。

2.2.3 調(diào)控細胞自噬 細胞自噬是一種細胞內(nèi)降解過程，可維持細胞的代謝平衡和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，當病毒感染宿主細胞后，一方面，宿主細胞利用細胞自噬將病毒送到溶酶體室進行降解和消除，另一方面，很多病毒進化出多種策略劫持自噬以進行自身復制；PDCoV N蛋白和nsp6蛋白均可顯著上調(diào)自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ的表達來誘導細胞自噬，說明PDCoV感染細胞能引起細胞自噬；隨后，使用自噬激活劑雷帕霉素誘導的LLC-PK1細胞和豬小腸上皮細胞的自噬均促進PDCoV N蛋白表達水平顯著上升，使用氯喹抑制自噬后PDCoV N蛋白表達水平顯著下調(diào)，這證明PDCoV誘導的細胞自噬能促進病毒自身復制[34-35]。

2.2.4 抑制細胞焦亡 細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是宿主機體內(nèi)重要的天然免疫反應(yīng)，病毒感染后，炎性caspase-1被激活可切割消皮素D(gasdermin D，GSDMD)，造成細胞穿孔引起細胞死亡，其能通過清除病毒感染的細胞從而減少細胞內(nèi)病原體的存活和增殖；GSDMD是細胞凋亡的執(zhí)行蛋白，其抗病毒活性是通過促進IFN-β的非經(jīng)典釋放和增強干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)反應(yīng)來介導[36]。PDCoV感染宿主細胞早期，nsp5蛋白可在Q193-G194連接處切割GSDMD，其切割片段在焦亡誘導中失活不能誘導細胞焦亡，這證明PDCoV感染可抑制細胞焦亡進而促進PDCoV在宿主細胞初始階段的復制[37]。

2.3 影響PDCoV復制的其他機制

PDCoV感染宿主細胞后引起大多數(shù)與免疫、炎癥反應(yīng)相關(guān)的細胞因子上調(diào)。鈣離子(Ca2+)是細胞內(nèi)廣泛存在的第二信使，能調(diào)控細胞的增殖分化、自噬、凋亡等過程，研究發(fā)現(xiàn)，多種病毒可通過調(diào)控細胞內(nèi)的鈣通道或鈣水平來促進自身感染與復制；PDCoV能調(diào)節(jié)鈣流入以促進病毒復制，鈣通道阻滯劑鹽酸地爾硫卓能抑制PDCoV感染過程中的復制階段，而L型鈣離子通道電壓門控通道亞基(CACNA1S)的敲除抑制了PDCoV復制[38]。

病毒不能獨立在自然環(huán)境中生存，其需要依賴宿主的細胞進行增殖。信號傳導轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)是能與PDCoV相互作用的宿主蛋白，并能在PDCoV感染中起負調(diào)控作用，使用CRISPR/Cas9構(gòu)建STAT1缺失的LLC-PK1細胞系發(fā)現(xiàn)其能導致病毒產(chǎn)量顯著增加，STAT1的缺失對病毒與細胞的附著影響不大，但卻能導致病毒內(nèi)化增加[39]。通過CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)對全基因組進行篩選發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位相關(guān)的多次跨膜蛋白TMEM41B參與了PDCoV復制，進一步利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、過表達和敲除試驗證明TMEM41B介導PDCoV復制復合體及雙層囊泡的形成,參與PDCoV的復制階段,進而影響PDCoV的增殖[40]。

目前為止，雖然人們對于PDCoV侵入宿主體內(nèi)并引起發(fā)病的分子機制進行了初步研究，但因其致病機理復雜多樣，PDCoV宿主體內(nèi)的感染機制，與宿主蛋白相互作用及頡頏天然免疫反應(yīng)方面還需更深入的研究和探討，可借鑒其他冠狀病毒致病機理的研究方法和進展，從而為闡明PDCoV致病機理提供新方向。

3 PDCoV診斷方法

因為PDCoV引起的臨床癥狀和病理變化與PEDV等其他腸道冠狀病毒具有很高相似性，還會出現(xiàn)混合感染的情況，需經(jīng)過實驗室診斷確診。目前PDCoV的實驗室診斷方法分為核酸檢測和抗體檢測，因PDCoVS、M和N基因具有保守性和抗原性，常被用作檢測靶標。核酸檢測方法主要有電子顯微鏡病毒顆粒檢測、病毒分離鑒定、聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)等；抗體檢測方法主要有膠體金免疫層析技術(shù)、病毒中和試驗(VN)、熒光微球免疫分析(FMIA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。在臨床實踐中，各檢測方法存在的自身優(yōu)勢和不足之處見表2，要合理利用診斷方法利于早期確診以達到防控目的。

表2 PDCoV 常用的檢測方法Table 2 Common detection methods of PDCoV

4 PDCoV疫苗開發(fā)及抗病毒治療

4.1 疫苗開發(fā)研究進展

疫苗是控制病毒感染最有效的手段，目前尚無PDCoV商品化疫苗，研究人員正利用各類開發(fā)平臺和技術(shù)開展對PDCoV疫苗的研究，已在滅活病毒疫苗、減毒活病毒疫苗、重組載體疫苗、病毒樣顆粒疫苗、乳酸菌載體口服疫苗等研究上取得了一定的進展。

4.1.1 滅活病毒疫苗 滅活病毒疫苗是對病原微生物使用化學或物理方法去除其感染性而仍保持其免疫原性，用β-丙內(nèi)酯滅活 PDCoV NH株第15代病毒制備PDCoV滅活疫苗，分別在妊娠母豬產(chǎn)前40和20 d用滅活疫苗進行免疫，隨后在母乳及出生仔豬血清中發(fā)現(xiàn)IgG及中和抗體，新生仔豬采食初乳后在5日齡用105TCID50的PDCoV進行攻毒試驗，結(jié)果證實PDCoV滅活疫苗為仔豬提供 87.1%的被動免疫保護率[50]。

4.1.2 減毒活疫苗 減毒活疫苗是一類將病原體經(jīng)過人工處理后，使病毒失去致病性，但保留了原有的增殖能力和免疫原性的疫苗，病毒毒力相關(guān)基因的缺失是一種有效的病毒致弱手段；PDCoV NS6蛋白能決定病毒毒力，研究人員用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因替換PDCoV的全長感染性cDNA克隆的NS6基因，構(gòu)建rPDCoV-ΔNS6-GFP，其在體外和體內(nèi)病毒滴度均顯著降低，且感染的仔豬沒有臨床癥狀或腸道病變，表明NS6的缺失導致病毒毒力減弱，NS6缺失突變毒株是候選減毒活疫苗毒株[15]。

4.1.3 重組載體疫苗 重組病毒載體疫苗是以病毒作為載體,將抗原基因重組到病毒基因組中,使用能表達抗原基因的重組病毒制成的疫苗，而豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)作為重組活疫苗載體已被應(yīng)用于多種病毒疫苗的研發(fā)，通過CRISPR/Cas基因編輯和同源重組技術(shù)構(gòu)建了表達PDCoV S蛋白的重組偽狂犬病病毒(rPRVXJ-delgE/gI/TK-S)，將其免疫小鼠后能表現(xiàn)良好的安全性和免疫原性，能上調(diào)小鼠外周血中IFN-γ和白細胞介素4(IL-4)的表達水平，促進小鼠脾臟中特異性T淋巴細胞的增殖，誘導高水平抗體的產(chǎn)生，在加強免疫后第7天，小鼠體內(nèi)檢測到了PRV gB和PDCoV S特異性抗體，且在免疫后第28天中和抗體水平達到最大值，該重組毒株可100%保護小鼠免受毒株的攻擊并降低小鼠體內(nèi)的PDCoV載量，因此有望成為PDCoV的候選重組疫苗[51]。

4.1.4 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是通過一種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白的體外或體內(nèi)自組裝合成的非遺傳多聚體納米顆粒，其在形態(tài)上保持了病毒抗原蛋白的天然構(gòu)象，但不帶有病毒遺傳物質(zhì)，因而沒有感染性，只有激發(fā)宿主免疫反應(yīng)的能力，VLPs可選取細胞、酵母、昆蟲等表達系統(tǒng)，制備成本低，可大規(guī)模生產(chǎn)。Guo等[52]首先合成冠狀病毒通用表位的噬菌體Qbeta外殼蛋白的嵌合VLP疫苗，之后用嵌合VLP疫苗對小鼠進行腹膜內(nèi)免疫，收集其血清，通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)VLP疫苗在小鼠體內(nèi)誘導了針對PDCoV的特異性抗體反應(yīng)，并且抗體具有中和活性，這證明VLP具有良好的免疫原性和安全性，可以作為疫苗開發(fā)的理想候選者。

4.1.5 乳酸菌載體口服疫苗 乳酸菌是一類能利用發(fā)酵的碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌，具有較強的黏附定植腸道上皮的能力，誘發(fā)腸道黏膜免疫，作為疫苗遞送載體具有潛在應(yīng)用前景；PDCoV S1結(jié)構(gòu)域中有多個產(chǎn)生中和抗體的重要表位，是受體識別、結(jié)合細胞的關(guān)鍵部位，郝嘉翼等[53]選用優(yōu)化的PDCoVS1基因并將其克隆至乳桿菌NZ3900,獲得高含量的重組質(zhì)粒，之后電轉(zhuǎn)入植物乳桿菌LP18中高效表達，為口服疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

4.2 抗病毒治療研究進展

目前尚無特效藥物用于治療PDCoV，一些廣譜抗病毒藥物、抗病毒分子蛋白和新型抗病毒技術(shù)在PDCoV抗病毒研究中顯示了良好的應(yīng)用前景，這給PDCoV抗病毒藥物的研發(fā)提供新的思路。

4.2.1 廣譜抗病毒藥物 瑞德西韋(Remdesivir,RDV)是一種腺苷類似物的單磷酰胺酸鹽前藥，其通過在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為三磷酸形式活化物(triphosphate form of remdesivir,RTP)，與天然三磷酸腺苷競爭結(jié)合病毒的依賴RNA型RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerases，RdRp)，之后插入RNA合成鏈，阻斷病毒RNA的復制，并抑制RdRp酶活性，以發(fā)揮對RNA病毒的抗病毒活性，研究發(fā)現(xiàn)在含胰蛋白酶和無血清培養(yǎng)基的人肝癌細胞(Huh7)中，瑞德西韋以劑量依賴性方式減少PDCoV的復制，半最大效應(yīng)濃度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)為0.02 μmol/L[54]。因此未來可將瑞德西韋作為治療PDCoV的潛在廣譜抗病毒藥物。

4.2.2 抗病毒分子蛋白 抗病毒藥物設(shè)計的策略可從直接殺滅病毒、干擾病毒侵入宿主細胞、抑制病毒核酸復制、組裝和釋放等方面著手，筆者總結(jié)了多種抗病毒分子蛋白通過靶向病毒本身或宿主因子來發(fā)揮抗病毒作用的具體途徑(表3)，這些分子蛋白有望成為抗PDCoV治療的新研究靶點，為PDCoV的抗病毒藥物研發(fā)提供新依據(jù)和新方向。

表3 抗PDCoV蛋白及作用途徑Table 3 Antiviral protein and its function pathway

4.2.3 抗病毒技術(shù) RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA在細胞體內(nèi)誘導靶向目的基因mRNA降解，從而使目的基因表達下降或沉默的現(xiàn)象，同時其還可作為一種新型技術(shù)手段用于抗病毒治療，通過構(gòu)建PDCoV的N基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)質(zhì)粒，能在體外試驗沉默基因的表達，抑制PDCoV的復制，對細胞抗PDCoV保護率達到92.7%，在仔豬體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)其能顯著保護腸組織抵御PDCoV感染所引起的特異性病變，提示采用RNAi治療PDCoV的潛力和可行性[62]。

綜上，雖然當前尚無PDCoV的商品化疫苗和特效治療藥物，但人類近年來應(yīng)對其他冠狀病毒的藥物研發(fā)技術(shù)和經(jīng)驗對PDCoV疫苗和治療藥物的研發(fā)具有重要借鑒意義。

5 展 望

近年來，對PDCoV蛋白功能、致病機理、診斷方法、疫苗開發(fā)、抗病毒治療等方面有了一定進展，但還有很多尚未解決的問題和難點，今后的研究重點可從以下幾個方面展開：①繼續(xù)研究PDCoV編碼蛋白的功能，可參考其他腸道冠狀病毒的蛋白功能研究PDCoV蛋白，有助于明確病毒的致病機理；②加強商品化疫苗的研發(fā)，疫苗接種是預防和控制傳染病的有效手段，目前尚未有商品化的疫苗問世，全球各地PDCoV毒株核苷酸同源性高，因此針對某一毒株進行研發(fā)能給全球PDCoV防控做好疫苗儲備；③發(fā)展快速即時高效的診斷技術(shù)，PDCoV凝集兔紅細胞的能力有助于PDCoV診斷方法的研發(fā)[63]。此外，可借助可視化、微流控芯片技術(shù)、納米材料生物傳感器等新技術(shù)開發(fā)新的診斷方法。

隨著幾種冠狀病毒跨越物種壁壘感染人類，新的冠狀病毒不斷出現(xiàn)，因此，需提高對冠狀病毒的警惕，加強對PDCoV的流行情況、致病機制及病原生物學的前瞻性研究，同時及時建立PDCoV的監(jiān)測預警機制讓監(jiān)管關(guān)口前移，從源頭阻斷疫病的傳播路徑，切實筑牢動物防疫生物安全屏障。