1株雞源腸炎沙門氏菌的分離鑒定及致病性分析

張?zhí)鹛?，呂文亮，林顯華，鹿 瑤，徐海燕，谷 巍，郝木強(qiáng)，盛永杰

(山東寶來利來生物工程股份有限公司,山東省動物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271017)

沙門氏菌(Salmonella)是革蘭氏陰性菌，桿狀，是重要的腸道致病菌。沙門氏菌屬是一個(gè)很大的菌屬，其血清型超2 600種[1]。腸炎沙門氏菌(SalmonellaEnteritidis)?？梢痣u、鴨等禽類感染，近年來，人們對沙門氏菌病例的調(diào)查表明，養(yǎng)殖場93%的雞檢測出沙門氏菌感染，認(rèn)為家禽及其副產(chǎn)品是最常見的傳染途徑[2-4]，與其他血清型沙門氏菌相比，腸炎沙門氏菌在蛋雞生殖道的定植能力更強(qiáng)[5]。沙門氏菌能通過輸卵管直接沉積在蛋黃中，從而躲過雞蛋的清洗和消毒，導(dǎo)致感染的蛋孵化率低，弱雛率和死亡率增加[6]，還會造成肉雞生長速度減緩、采食量下降和腸炎性腹瀉、死亡等癥狀，對肉雞養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。更重要的是，沙門氏菌可引起食物中毒[8]。近年來，疾病預(yù)防控制中心報(bào)告的病例發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏菌是引起疾病的主要血清型之一[9]，據(jù)報(bào)道，2021年歐洲包括英國在內(nèi)的6個(gè)國家報(bào)道了272例確診的腸炎沙門氏菌ST11感染病例[10]。

為確定云南某蛋雞場疑似沙門氏菌病病料中的主要病原菌的種類和生物學(xué)特性，本試驗(yàn)進(jìn)行了沙門氏菌的分離、鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)及動物致病性試驗(yàn)，以期為沙門氏菌病的臨床診斷和有效防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 樣品及試驗(yàn)動物

病死雞來源于云南某蛋雞養(yǎng)殖場。20只4日齡健康海蘭褐雛雞購自泰安東岳種禽有限公司。

1.2 主要試劑

SS瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、沙門氏菌生化鑒定條、TSI瓊脂、半固體瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基、革蘭氏染液均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和2×TaqPCR MasterMix均購自天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；沙門氏菌診斷血清試劑盒購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌條件下取病死雞肝臟，加入無菌生理鹽水研磨，制成組織勻漿液，劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取SS瓊脂培養(yǎng)基平板上無色透明的小菌落，接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。取沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上的紫色菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基平板，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

1.4 生化鑒定

使用沙門氏菌生化鑒定條對分離菌進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定,參照《GB 4789.4-2016》[11]進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 血清學(xué)鑒定

按沙門氏菌屬診斷血清試劑盒使用說明書，采用玻片凝集法進(jìn)行血清學(xué)鑒定。于潔凈玻片上滴加沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)血清，將菌苔加入少量滅菌生理鹽水制成菌液，取少量菌液與血清混合均勻，2 min內(nèi)判斷結(jié)果，同時(shí)設(shè)置生理鹽水為陰性對照。

1.6 16S rRNA鑒定

取分離菌株，接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)好的菌液按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，并以此為模板，選用16S rRNA通用引物(1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；27F：5′-AGA-GTTGATCCTGGCTCAG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL:2×TaqPCR MasterMix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 2 μL，超純水21 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳完畢后用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，在NCBI網(wǎng)站通過BLAST比對分析，確定細(xì)菌種屬。選取11株沙門氏菌屬代表菌株的16S rRNA核苷酸序列通過軟件Mega 11.0的鄰接法(NJ)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.7 毒力基因檢測

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行毒力基因檢測。參考楊文文等[12]合成15對沙門氏菌毒力基因檢測引物(表1)，包含毒力島基因、毒力質(zhì)粒基因、腸毒素基因、菌毛毒力基因檢測引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL:2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，超純水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察并拍照。

1.8 對雞的致病性試驗(yàn)

將20只4日齡健康雛雞隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組和對照組，每組10只。將分離菌接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，平板菌落計(jì)數(shù)至含菌量為4.2×108CFU/mL，經(jīng)嗉囊軟管灌喂試驗(yàn)組雛雞，0.5 mL/只，對照組灌喂等體積無菌生理鹽水，觀察雛雞發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)死亡率，取病死雞的肝臟進(jìn)行致病菌分離培養(yǎng)。

1.9 藥物敏感性試驗(yàn)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)測定分離菌株的藥物敏感性。無菌條件下將純化的菌液均勻涂布在TSA瓊脂平板上，貼好藥敏紙片后，于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測定抑菌圈直徑大小。參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI 2019)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定敏感、中介、耐藥。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

分離菌株在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成直徑為1～2 mm表面光滑、邊緣整齊、無色透明的圓形菌落(圖1A)，在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形紫色菌落(圖1B)，在TSA培養(yǎng)基上呈半透明乳白色小菌落(圖1C)。經(jīng)鏡檢觀察，菌體呈小短桿至球桿狀，革蘭氏染色陰性(圖1D)。初步判定分離菌株為疑似沙門氏菌，命名為S2。

A～C，分別為分離菌在SS瓊脂培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；D，革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(1 000×) A，Colony morphology of the isolate on SS agar medium,Salmonella chromogenic medium and TSA medium，respectively；D，Gram staining microscopic examination results(1 000×)圖1 分離菌培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察Fig.1 Culture characteristics and morphological observation of the isolated bacteria

2.2 生化鑒定與血清學(xué)鑒定結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株S2接種的三糖鐵斜面，斜面產(chǎn)堿，底層產(chǎn)酸，產(chǎn)硫化氫；賴氨酸脫羧酶、衛(wèi)矛醇試驗(yàn)為陽性；靛基質(zhì)、尿素酶、氰化鉀、山梨醇、水楊苷、β-半乳糖苷、丙二酸鹽生化試驗(yàn)結(jié)果均為陰性(表2)，判斷菌株S2為典型沙門氏菌屬菌株。血清學(xué)鑒定結(jié)果表明，菌株S2與O多價(jià)、O1、O9、O12、H多價(jià)、Hg和Hm血清反應(yīng)為陽性，與其他血清反應(yīng)為陰性。參照沙門氏菌診斷抗原表,確定菌株S2屬于D群腸炎沙門氏菌，其抗原結(jié)構(gòu)式為1,9,12：g,m。

表2 分離菌生化鑒定結(jié)果Table 2 Results of biochemical identification of the isolated strains

2.3 分離菌16S rRNA鑒定結(jié)果

分離菌16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，獲得大小約為1 500 bp的目的片段(圖2)，測序結(jié)果為1 405 bp。將測得序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果顯示，菌株S2與腸炎沙門氏菌代表株MT621365(馬來西亞)相似性最高，為99.86%；遺傳進(jìn)化樹顯示，菌株S2與腸炎沙門氏菌MT621365聚為一簇(圖3)，自展值為99%，因此，菌株S2可鑒定為腸炎沙門氏菌。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，菌株S2 M，DL2000 DNA Marker；1 and 2，Strain S2圖2 分離菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA gene of the isolate

圖3 分離菌S2與參考菌株基于16S rRNA基因序列的遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the isolated strain S2 and reference strains based on 16S rRNA gene sequence

2.4 毒力基因檢測

沙門氏菌毒力基因檢測結(jié)果顯示，菌株S2 13種毒力基因invJ、hilA、ssaB、misL、mgtC、orf319、sopB、spvA、spvB、spvC、spvR、stn和fimA基因均呈陽性，而sopA、fliC這2個(gè)毒力基因沒有擴(kuò)增出目的條帶(圖4)。

M，DL2000 DNA Marker；1～15，分別為invJ、sopA、hilA、ssaB、misL、mgtC、orf319、sopB、fliC、spvA、spvB、spvC、spvR、stn和fimA基因 M，DL2000 DNA Marker;1-15,invJ, sopA, hilA, ssaB, misL, mgtC, orf319, sopB, fliC,spvA, spvB, spvC, spvR, stn and fimA genes，respectively圖4 分離菌S2毒力基因檢測結(jié)果Fig.4 Identification results of virulence gene of S2 strain

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組雛雞在接種4 d后全部開始發(fā)病，出現(xiàn)精神萎靡、畏寒癥狀，接種后6 d雛雞全部死亡；對照組雛雞正常生長，未見不良癥狀。剖檢死亡雛雞可見肝臟壞死點(diǎn)、脾臟腫大出血、腎臟腫大的癥狀，沙門氏菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽性。

2.6 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

在測定的15種常用藥物中，腸炎沙門氏菌S2株對阿莫西林-克拉維酸、頭孢西丁、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、四環(huán)素等12種藥均敏感，對甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明和林可霉素耐藥(表3)。

表3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results

3 討 論

沙門氏菌屬腸桿菌科人獸共患革蘭氏陰性菌，是食源性疾病的常見病原體，在人上通常引起胃腸性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國有70%～80%的細(xì)菌性食物中毒是由沙門氏菌引起的，引起中毒的食品主要為肉、蛋、奶類動物產(chǎn)品[13]。歐盟關(guān)于食源性疾病調(diào)查顯示，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)是引起沙門氏菌感染最常見的2種血清型[14-15]。在中國，也有多項(xiàng)研究表明，腸炎沙門氏菌為禽沙門氏菌的優(yōu)勢血清型。如趙建梅等[16]統(tǒng)計(jì)了2008-2017年從中國部分地區(qū)分離的禽源沙門氏菌分型，結(jié)果表明，腸炎沙門氏菌是中國禽沙門氏菌的優(yōu)勢血清型；王迪軒等[17]從華中地區(qū)分離的124株沙門氏菌以腸炎沙門氏菌(63.71%)和雞白痢沙門氏菌(27.42%)為優(yōu)勢血清型。一直以來，腸炎沙門氏菌感染都是世界范圍內(nèi)普遍關(guān)注的問題，其流行病學(xué)調(diào)查具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本研究從云南某蛋雞場疑似沙門氏菌病病料中分離出1株腸炎沙門氏菌，并對其致病能力進(jìn)行了檢測。腸炎沙門氏菌宿主譜廣泛，在人和禽中的分離率較高，可引發(fā)畜禽胃腸炎及人類的腸炎和食物中毒[18]。在禽上，沙門氏菌會引起胃腸道炎癥、脾炎、肝炎等疾病，導(dǎo)致雞免疫功能下降、生長速度降低、死亡率升高[19]。沙門氏菌的致病性與其含有的毒力基因存在著緊密聯(lián)系，包括毒力島基因、毒力質(zhì)?；?、腸毒素基因等[20]。本研究對分離菌株S2進(jìn)行了15個(gè)毒力基因(invJ、sopA、hilA、ssaB、misL、mgtC、orf319、sopB、fliC、spvA、spvB、spvC、spvR、stn和fimA基因)的檢測，其中有2個(gè)基因sopA和fliC未被檢測到。毒力島基因invJ、hilA、ssaB、misL、mgtC、orf319、sopB，毒力質(zhì)粒基因spvA、spvB、spvC、spvR對菌體的致病性均有決定性作用，stn為腸毒素基因，可調(diào)節(jié)特定血清型菌體產(chǎn)生具有毒性的可溶性蛋白[21]；fimA為菌毛基因，可促進(jìn)細(xì)菌對靶位點(diǎn)的黏附和定植[22]。結(jié)合動物致病性結(jié)果表明，腸炎沙門氏菌菌株S2致病能力較強(qiáng)，對雛雞的致死率很高，各養(yǎng)殖場應(yīng)重視并及時(shí)做好沙門氏菌的檢驗(yàn)和凈化工作。

禽源沙門氏菌耐藥形勢不容樂觀，對大部分抗生素的耐藥率呈上升趨勢[23-25]。研究顯示，在中國，禽源沙門氏菌對氨芐西林、四環(huán)素、萘啶酸等的耐藥率高于50%[26]。湯全英等[27]研究結(jié)果顯示，在35株腸炎沙門氏菌菌中，氨芐西林/舒巴坦和氨芐西林耐藥率為82.9%，四環(huán)素和氯霉素的耐藥率為71.4%，頭孢唑啉耐藥率為62.9%，萘啶酸和紅霉素耐藥率為100%。李廷翠等[28]研究結(jié)果顯示，腸炎沙門氏菌分離株對青霉素、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素和四環(huán)素4種藥物耐藥。本研究利用15種抗菌藥對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測定，菌株S2對阿莫西林-克拉維酸、頭孢西丁、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、四環(huán)素等12種抗菌藥敏感，對甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明和林可霉素耐藥，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道的腸炎沙門氏菌具有多重耐藥性的結(jié)果一致，但耐藥藥物種類有差別，這可能與不同養(yǎng)殖場的抗菌藥使用有一定關(guān)系。臨床用藥應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況而定，建議養(yǎng)殖場定期開展細(xì)菌藥敏監(jiān)測，篩選高度敏感藥物進(jìn)行治療，并且制定合理、科學(xué)的使用方法。

4 結(jié) 論

本研究分離到1株腸炎沙門氏菌,其毒力較強(qiáng)，攜帶invJ、hilA、ssaB等毒力基因，用4.2×108CFU/mL的分離菌攻毒健康雛雞，雛雞死亡率達(dá)100%，同時(shí)引起雛雞肝臟、脾臟、腎臟等組織發(fā)生不同程度的病變。分離株對阿莫西林-克拉維酸、頭孢西丁、慶大霉素等抗菌藥敏感，對甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明和林可霉素耐藥。