1,2-丁二醇輔助氨基糖苷類抗生素殺滅大腸桿菌效果分析

馮荊城，莊彬彬，李中燕，馬月龍，李心想，陳雅娟

(細胞逆境響應與代謝調控福建省高校重點實驗室/福建師范大學生命科學學院， 福建 福州 350108)

1928年，亞歷山大·弗萊明醫生在實驗中偶然發現青霉菌具有殺滅清除細菌的作用，進而找到了青霉素這一具有抗擊傳染性疾病的強效藥物，并在第二次世界大戰中挽救了無數受傷士兵的生命，這預示了“抗生素時代”的到來[1]。至此開始，抗生素被廣泛發現并應用于醫療衛生、農業養殖等領域，成為保證人類健康、防治動物疫病以提高養殖效益的一大必備藥品[2-3]。抗生素的臨床應用可以說是20世紀最大的醫學突破[4]。

隨著抗生素的廣泛使用，也引發諸多問題，其中最引人關注的即是抗生素的濫用致使病原菌對抗生素逐漸演化出耐藥性，該現象在近幾十年愈演愈烈，嚴重威脅病人生命與健康[5-6]，同時威脅農業生產系統的可持續性，并對經濟發展造成巨大影響。因此，在2014年世界衛生組織已將抗生素耐藥列為21世紀最重要的公共衛生威脅之一[7]。有調查預測，若不采取措施使當前存在的不合理使用抗生素的趨勢繼續演化下去，到2050年，全球每年將有1 000萬人死于耐藥性感染[8]。

細菌面對不同抗生素的殺滅作用已經進化出了復雜的耐藥機制。(1)產生鈍化酶[9]；(2)耐藥菌進化出主動外排機制[10]；(3)抗生素殺菌靶點修飾[11]；(4)降低外膜滲透性[12]。針對以上錯綜復雜的耐藥機制，研究人員將目光聚焦在：(1)研發新型抗生素；(2)探索新的殺菌靶點和抑制劑；(3)尋找能夠輔助現有抗生素殺菌的佐劑及方法策略。而自從20世紀70年代開始，抗生素新藥研發進展緩慢，研發周期長、資金投入巨大，許多生物公司已經停止相關項目[13]。提高現有抗生素殺菌效率或者尋找新的殺菌靶點和抑制劑或許才是未來有效解決細菌耐藥的方法，研究人員通過外源添加葡萄糖[14]、5-甲基吲哚[15]、正丁醇[16]、丙氨酸[17]增強氨基糖苷類抗生素殺菌效果，也尋找出一系列輔助殺菌的方法策略，例如：低離子休克[18]、冰凍[19]等。與抗生素單處理相比，上述佐劑及方法均可在較短時間內提高抗生素殺菌效率，這種“新瓶裝舊酒”的殺菌方式在未來應用潛力巨大。

實驗室已有的研究發現，正丁醇能夠較好地輔助氨基糖苷類抗生素殺滅金黃色葡萄球菌持留菌、MRSA及多種致病菌[16]，看到了醇類在抗擊細菌耐藥方面的巨大潛力。本研究共測試了8種丁醇類有機化合物與妥布霉素雙處理對平臺期大腸桿菌進行殺滅5 h的殺菌效果，從中篩選出了1,2-丁二醇(1,2-Butanediol，BD)具有良好的輔助氨基糖苷類抗生素殺滅大腸桿菌的作用。1,2-丁二醇廣泛應用于醫藥、化妝品保濕劑、穩定劑、增塑劑等領域[20]。本研究首次發現1,2-丁二醇在輔助傳統殺菌型抗生素增效方面的良好效果，未來有望拓展1,2-丁二醇在醫藥和農業領域的應用，為抗生素“增效減毒”做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以大腸桿菌模式菌株BW25113為試驗材料，10株臨床耐藥大腸桿菌由福建醫科大學第一附屬醫院饋贈。

氨基糖苷類抗生素：妥布霉素(Tob)、慶大霉素(Genta)、鏈霉素(Strep)、卡那霉素(Kana)、阿米卡星(Amk)、奈替米星(Net)。β-內酰胺類抗生素：氨芐青霉素(Amp)、羧芐青霉素(Car)。喹諾酮類抗生素：氧氟沙星(Ofl)、環丙沙星(Cip)。

1.2 試驗方法

1.2.1菌種活化及稀釋點板方法 菌種活化：吸取-80℃凍存的大腸桿菌菌液1 μL，加入到1 mL LB液體培養基中，于搖床(37℃，220 r·min-1)培養12 h進行菌種活化，所得菌液稀釋500倍，接種于20 mL的LB液體培養基中，于搖床(37℃，220 r·min-1)培養24 h，即得平臺期大腸桿菌菌液。

稀釋點板：經不同試驗要求處理后吸出50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1，2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌兩次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體(使其與原菌液相同體系)。所得菌液按每次10倍的梯度用PBS緩沖液稀釋，稀釋梯度為101、102、103、104、105，每個稀釋度取4 μL菌液點鍍在LB固體培養基平板上，倒置于37℃恒溫培養箱12 h后，檢查細菌死亡并進行計數，計算大腸桿菌經處理后的存活率(注：殺菌測試試驗的菌液活化、洗脫、點板均與上述方法相同，僅是處理時的抗生素類型、濃度，1,2-丁二醇的濃度及處理時間不同)。

1.2.28種丁醇類化合物與妥布霉素雙處理殺滅平臺期大腸桿菌效果測試 取平臺期大腸桿菌，分別吸取500 μL菌液分裝于18個無菌玻璃搖菌管中，編號為1～18。1號管作為空白對照組不經任何處理，2～9號管內分別加入正丁醇、異丁醇、叔丁醇、2-丁醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇，濃度為30 mmol·L-1，10號管中加入妥布霉素(200 μg·mL-1)作為妥布霉素單處理組，11～18號管分別按序加入上述8種醇(30 mmol·L-1)，并分別加入妥布霉素(200 μg·mL-1)，將上述18個搖菌管置于37℃搖床(220 r·min-1)孵育5 h處理。

1.2.31,2-丁二醇輔助妥布霉素殺滅平臺期大腸桿菌的濃度梯度測試 取平臺期大腸桿菌，分別吸取500 μL菌液分裝于20個無菌玻璃搖菌管中，編號為1～20。1～10號管為1,2-丁二醇單處理組，設置1,2-丁二醇濃度梯度為0(未添加1,2-丁二醇的空白對照組)、1、3、5、8、10、30、50、80、100 mmol·L-1；11～20號管為1,2-丁二醇與妥布霉素雙處理組，在按序添加上述1,2-丁二醇濃度后，在每管中再添加妥布霉素(200 μg·mL-1)，將上述20個搖菌管置于37℃搖床(220 r·min-1)孵育5 h處理。

1.2.41,2-丁二醇輔助殺菌型抗生素殺滅平臺期大腸桿菌效果測試 1,2-丁二醇與3類殺菌型抗生素聯合應用處理：取平臺期大腸桿菌，分別吸取500 μL菌液分裝于14個無菌玻璃搖菌管中，編號為1～14。1號管為未處理空白對照組，2～7管為抗生素單處理組，其中2～3號管分別添加妥布霉素、慶大霉素(各200 μg·mL-1)，4～5號管分別添加氨芐青霉素、羧芐青霉素(各2000 μg·mL-1)，6～7號管分別添加氧氟沙星、環丙沙星(各10 μg·mL-1)；8號管為1,2-丁二醇單處理組(濃度為50 mmol·L-1)，9～14號管為抗生素與1,2-丁二醇雙處理組，在按序添加了上述抗生素后，在每管中再添加1,2-丁二醇(50 mmol·L-1)，將上述14個搖菌管置于37℃搖床(220 r·min-1)孵育5 h處理。

1,2-丁二醇與6種氨基糖苷類抗生素雙處理：6種氨基糖苷類抗生素各設置2個濃度，分別為妥布霉素(Tob1=200 μg·mL-1、Tob2=500 μg·mL-1)、慶大霉素(Genta1=100 μg·mL-1、Genta2=200 μg·mL-1)、鏈霉素(Strep1=200 μg·mL-1、Strep2=500 μg·mL-1)、卡那霉素(Kana1=1 000 、Kana2=1 500 μg·mL-1)、阿米卡星(Amk1=1 000 μg·mL-1、Amk2=1 500 μg·mL-1)、奈替米星(Net1=100 μg·mL-1、Net2=200 μg·mL-1)，以妥布霉素的處理為例，取活化后所得平臺期大腸桿菌，分別吸取500 μL菌液分裝于5個無菌玻璃搖菌管中,編號為1～5。1號管為0 h未處理組，2號管、3號管分別添加妥布霉素200、500 μg·mL-1，4號管、5號管在分別添加上述妥布霉素外再添加1,2-丁二醇(50 mmol·L-1)，然后放置到搖床(37 ℃，220 r·min-1)孵育，設置0～5 h時間梯度，每1 h取樣50 μL進行點板。其余5種抗生素均以上述方法進行處理。

1.2.5妥布霉素攝取 (1)標準品制備：分別吸取平臺期大腸桿菌1 mL置于6管1.5 mL EP管中，13 000 r·min-1，2 min離心，去上清，PBS洗脫3次，加入100 μL溶菌酶(2 mg·mL-1)于菌樣中，用移液槍小心吹打菌樣混勻；然后分別加入不同濃度的妥布霉素，設置0、20、40、60、80、100 μg·mL-1的妥布霉素濃度梯度。(2)試驗樣品制備：分別吸取1 mL平臺期大腸桿菌菌液于4個玻璃搖菌管中，編號為1～4，妥布霉素濃度為管1、2：200 μg·mL-1，管3、4：500 μg·mL-1，再往管2、4加入1,2-丁二醇(50 mmol·L-1)，將這4管放置到37℃搖床220 r·min-1處理3 h轉移至1.5 mLEP管中，離心后去上清，PBS洗脫3遍，洗去細菌表面殘留妥布霉素，最后加入100 μL溶菌酶于菌樣中吹打混勻。

將上述標準品及試驗樣品放置到翻轉混勻儀上室溫裂解3 h。裂解完成后置于-80℃超低溫冰箱中冰凍2 min，然后取出靜置等待融化，反復凍融3次使細菌充分裂解，接著將其放到90℃加熱10 min，使溶菌酶失活。待冷卻后離心，吸取上清液至新的1.5 mLEP管中做好標記，然后將上清液點鍍在涂滿對數期大腸桿菌的平板上，每個樣品重復3次，待吹干后置于37℃恒溫培養箱內倒置過夜培養。最后測量抑菌圈的直徑，計算標準品的抑菌圈面積，作出標準曲線，將樣品的抑菌圈面積代入公式中即可測算出試驗樣品組的大腸桿菌攝取抗生素的情況。

1.2.61,2-丁二醇輔助妥布霉素、慶大霉素殺滅臨床耐藥大腸桿菌 在進行預試驗時根據不同株臨床大腸桿菌的耐藥程度選擇不同濃度的抗生素，其中210215749、210215826、210305607、210215736、210305638、210409104、210215869這7株菌的妥布霉素、慶大霉素濃度均選擇500 μg·mL-1，210829776、210117528、210305622這3株菌的妥布霉素、慶大霉素濃度均選擇200 μg·mL-1。以210215749菌株為例，取活化后所得平臺期210215749，分別吸取500 μL于4個玻璃搖菌管中，1～2號管分別添加妥布霉素、慶大霉素(500 μg·mL-1)，3～4號管在添加上述同等抗生素后，在每管中再添加1,2-丁二醇(50 mmol·L-1)，然后放置到搖床(37℃，220 r·min-1)孵育處理5 h，剩余9株菌株均以同樣方法進行處理。

1.3 數據處理與分析

試驗中的數據統計通過ANOVA算法進行分析，數據來源于3次獨立試驗。

2 結果與分析

2.1 8種丁醇類化合物與妥布霉素雙處理殺滅平臺期大腸桿菌效果測試

由圖1可知，處理5 h后，8組丁醇類化合物(30 mmol·L-1)單處理與空白對照組在殺菌效果上沒有顯著性差異。妥布霉素(200 μg·mL-1)單處理與空白對照組相比僅展現了輕微的殺菌作用，殺菌數量在1個數量級以內。而8種丁醇類化合物分別與妥布霉素進行雙處理的測試結果中，1,2-丁二醇與妥布霉素雙處理的殺菌效果與妥布霉素單處理相比增強了約5個數量級的殺菌效果。可見，在這8種丁醇化合物中，1,2-丁二醇對妥布霉素殺滅大腸桿菌的輔助效果最具潛力，因此選用1,2-丁二醇用于后續研究。

注：“control”表示無添加任何醇類，“-”表示無添加妥布霉素，“+”表示添加妥布霉素

2.2 1,2-丁二醇輔助妥布霉素殺滅平臺期大腸桿菌的濃度梯度測試

由圖2可知，1，2-丁二醇單處理在0～100 mmol·L-1濃度梯度范圍內均無顯著殺菌現象。而采用1，2-丁二醇與妥布霉素雙處理后，在1,2-丁二醇濃度低至3 mmol·L-1時即出現了輔助妥布霉素殺菌的現象，并且隨著1,2-丁二醇濃度越高輔助妥布霉素殺滅大腸桿菌效果越顯著，在1,2-丁二醇濃度為10～50 mmol·L-1時輔助妥布霉素殺菌效果出現了較大的跨度，50 mmol·L-1與80 mmol·L-1殺菌效果對比無顯著性差異(P>0.05)，因此后續研究將1,2-丁二醇濃度定為50 mmol·L-1。

注：NS表示差異不顯著(P>0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

2.3 1,2-丁二醇輔助殺菌型抗生素殺滅平臺期大腸桿菌效果測試

從圖3A結果可知，在處理5 h后，1,2-丁二醇輔助妥布霉素、慶大霉素這兩種氨基糖苷類抗生素殺滅平臺期大腸桿菌效果明顯，組間差異極顯著(P<0.000 1)；而1,2-丁二醇與喹諾酮類抗生素中的氧氟沙星雙處理，1,2-丁二醇僅具有一定的輔助殺菌的效果(P<0.05)，與環丙沙星的雙處理中，1,2-丁二醇在輔助殺菌上的效果通過統計學分析無顯著性差異(P>0.05)；此外，針對同屬于青霉素類抗生素的氨芐青霉素和羧芐青霉素，1,2-丁二醇均無顯著性輔助殺菌作用(P>0.05)。可見，在這3類殺菌型抗生素中，1，2-丁二醇輔助氨基糖苷類抗生素的殺菌效果最佳，這可能是由于不同抗生素的殺菌機制、抗生素的分子大小不同導致的。

注：A為1,2-丁二醇輔助3類殺菌型抗生素殺滅平臺期大腸桿菌效果測試；B-F為1,2-丁二醇輔助6種氨基糖苷類抗生素殺滅平臺期大腸桿菌效果測試；Tob1表示妥布霉素濃度為200 μg·mL-1、Tob2表示妥布霉素濃度為500 μg·mL-1；Gen1表示慶大霉素濃度為100 μg·mL-1、Gen2表示慶大霉素濃度為200 μg·mL-1；Strep1表示鏈霉素濃度為200 μg·mL-1、Strep2表示鏈霉素濃度為500 μg·mL-1；Kana1表示卡那霉素濃度為1 000 μg·mL-1、Kana2表示卡那霉素濃度為1 500 μg·mL-1；Amk1表示阿米卡星濃度為1 000 μg·mL-1、Amk2表示阿米卡星濃度為1 500 μg·mL-1；Net1表示奈替米星濃度為100 μg·mL-1、Net2表示奈替米星濃度為200 μg·mL-1；NS表示組間沒有顯著性差異；*表示差異顯著(P<0.05)；****表示差異極顯著(P<0.000 1)

為了驗證1,2-丁二醇在輔助氨基糖苷類抗生素作用上是否具有廣譜效應，本研究測試了6種氨基糖苷類抗生素與1,2-丁二醇雙處理的殺菌效果，分別是妥布霉素、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星，且每種抗生素選擇2個濃度，并設置0～5 h的時間梯度。由圖3B～F可知，1,2-丁二醇對6種氨基糖苷類抗生素均有輔助殺菌作用，且殺菌數量與抗生素濃度、處理時間成正相關。該結果證實1,2-丁二醇對氨基糖苷類抗生素具有廣譜輔助殺菌的作用。

2.4 抗生素攝取試驗結果

為了探究1,2-丁二醇輔助氨基糖苷類抗生素殺菌是基于何種機制，本研究進一步測試了大腸桿菌胞內抗生素攝取情況。由圖4A結果可知，標準品組中的抑菌圈面積與妥布霉素濃度成正比。將樣品組抑菌圈面積數值代入到標準曲線公式：y=0.017 9x-0.236 6中，即可獲得各樣品組大腸桿菌中抗生素的攝取情況，標準曲線、定量結果見圖4B、4C，當妥布霉素濃度為200 μg·mL-1時，其單處理的妥布霉素攝取平均值為15.28 μg·mL-1，1,2-丁二醇與妥布霉素雙處理的妥布霉素攝取平均值為19.67 μg·mL-1；當妥布霉素濃度為500 μg·mL-1時，其單處理的妥布霉素攝取平均值為23.46 μg·mL-1，1,2-丁二醇與妥布霉素雙處理的妥布霉素攝取平均值為31.75 μg·mL-1，1,2-丁二醇和妥布霉素雙處理組與妥布霉素單處理組對比，雙處理組可以顯著提高大腸桿菌細胞中妥布霉素的含量，妥布霉素濃度越高差異越顯著。該結果提示1,2-丁二醇可通過增強大腸桿菌對妥布霉素的攝取進而輔助妥布霉素殺菌。

注：A為1,2-丁二醇輔助不同濃度的妥布霉素處理平臺期大腸桿菌后形成的抑菌圈；B為抑菌圈標準曲線；C為1,2-丁二醇的添加促進大腸桿菌對妥布霉素的攝取；NS表示差異不顯著(P>0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

2.5 1,2-丁二醇輔助妥布霉素、慶大霉素殺滅臨床耐藥大腸桿菌

為了驗證1,2-丁二醇在臨床耐藥方面的應用價值，本研究從福建醫科大學第一附屬醫院獲得10株臨床上分離的大腸桿菌耐藥菌株，其耐藥特性見表1。

表1 10株臨床耐藥大腸桿菌具體信息

由表2可知，在這10株臨床分離的耐藥大腸桿菌中，與妥布霉素單處理組相比，1,2-丁二醇聯合妥布霉素雙處理對其中7株的殺滅效果有顯著增強，其中1,2-丁二醇對210215749、210305607這兩株大腸桿菌的輔助殺滅效果極顯著，可提高妥布霉素4個數量級的殺菌效果。但對于210215736、210409104、210215869這3株大腸桿菌無輔助殺菌效果；另外，與慶大霉素單處理組相比，1,2-丁二醇聯合慶大霉素雙處理對其中4株耐藥大腸桿菌的殺滅效果有顯著增強。

表2 1,2-丁二醇增強妥布霉素、慶大霉素殺滅臨床大腸桿菌效果

3 結論與討論

我國是抗菌藥物生產和使用大國。抗生素廣泛應用于醫療衛生、農業養殖等領域，在治療人類感染性疾病、防治動物疫病以及保障公共衛生安全中發揮重要作用。但由于抗生素在醫療衛生領域和動物衛生領域的過度使用或者誤用，不僅使抗生素對人體、養殖動物的毒副作用增加，甚至還會致使敏感菌進化成耐藥菌[21]，尤其是一些多重耐藥菌的出現，嚴重影響抗生素對細菌感染性疾病的治療成功率[22]。而抗生素新藥的研發進度目前已不能滿足臨床治療上的需要，尋找其他有效應對耐藥細菌的方法策略在臨床治療上已經迫在眉睫。

本研究從8種丁醇中篩選出能夠顯著有效輔助氨基糖苷類抗生素殺菌效果的1,2-丁二醇，并證實其與妥布霉素、慶大霉素聯合應用處理對臨床部分耐藥大腸桿菌有一定的輔助殺菌作用。抗生素攝取試驗結果提示，1,2-丁二醇能夠促進大腸桿菌對抗生素的攝取可能是其起到輔助殺菌效果的機制之一。研究結果可為尋找新型有效地增強抗生素殺菌效果的方法提供新的思路，并為有效降低病原菌產生耐藥風險提供新的策略。