五爪金龍抑制香蕉枯萎病有效成分的鑒定與抑菌效果分析

顧承真，高鈺杰，邱子宿，呂 晶，李 婷，曾任森

(1.福建農林大學生命科學學院， 福建 福州 350002； 2.福建農林大學作物科學學院作物抗性與化學生態學研究所， 福建 福州 350002)

香蕉枯萎病Fusarium wilt of banana主要是由尖孢鐮刀菌古巴專化型Fusariumoxysporumf.sp.cubenseFOC引起的維管束病害，嚴重制約香蕉產業的發展，其具有分布廣、發病快的特點，每年給香蕉產業造成巨大的經濟損失，也稱為香蕉的癌癥[1]。目前，主要通過化學防控[2]、輪作其他作物[3]、農藝措施防控[4]和生物防控措施等[5]來應對香蕉枯萎病的發生和危害。化學農藥防治效果比較直接、高效，易造成環境污染、農藥殘留、食品安全和病原菌抗藥性增加等問題[6]；輪作會降低香蕉的經濟收入[7]；通過香蕉-水稻輪作聯合添加有機肥料的農藝措施[4]起不到很好的防治效果；生物防控大多采用生物有機肥料和菌劑來抑制病原菌，雖然不會帶來環境問題，但其效果并不穩定[8]。目前，香蕉枯萎病還沒有較好的防治方法。

植物是生物活性化合物的天然寶庫，植物源農藥的有效成分是植物的次生代謝產物，如生物堿類、黃酮類、萜類和酚類等。植物源農藥具有易降解、不會造成環境污染、靶標有害生物不易產生抗藥性、對非靶標生物安全、防治農作物病害效果穩定等特點[9]。五爪金龍IpomoeacairicaLinn.Sweet為旋花科Convolvulaceae番薯屬 Ipomoea多年生藤本植物，主要分布在熱帶地區，在我國主要分布在南部，是外來入侵物種之一[10]。五爪金龍在生長過程中能夠產生大量的次生代謝產物，比如黃酮[11]、木脂素[12]、香豆素[12]、脂肪酸[13]、揮發油[14-15]等。這些次生代謝產物不僅具有十分重要的研究和應用價值，還是五爪金龍入侵的武器。五爪金龍葉片水提取液可以使薇甘菊Mikaniamicrantha的葉綠素含量降低，從而抑制光合作用，并且對種子的萌發及根的生長具有明顯的抑制效應[16]。五爪金龍乙醇提取物對柑橘潛葉蛾Phyllocnistiscitrella的產卵具有驅避作用[17]，對于福壽螺Pomaceacanaliculata具有致死作用[18]。此外，五爪金龍提取物還具有體外抗腫瘤活性[19]，其中含有的異綠原酸具有鎮痛作用[20]。五爪金龍對農作物病害及農作物病原菌生長的影響目前尚無報道。本課題組近期研究發現，五爪金龍乙醇提取物能較好地抑制香蕉枯萎病病原菌的生長，但具有抗菌活性的化學物質尚不清楚。因此，本研究對五爪金龍乙醇提取物化學成分進行研究，以期從中找到具有抑制香蕉枯萎病病原菌的物質基礎，為植物源綠色農藥的開發提供先導化合物，并為五爪金龍的應用和香蕉枯萎病的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

五爪金龍于2017年6月采自福建農林大學校園內。香蕉枯萎病病原菌Fusariumoxysporumf.sp.cubenseFOC菌株由福建農林大學農學院提供。馬鈴薯購于福建農林大學愛購超市，葡萄糖和瓊脂購于貝爾曼公司。

1.2 試驗儀器

核磁共振波譜儀(Bruker)、高分辨質譜(Agilent)、旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)、超凈工作臺(蘇凈安泰VS-840K-U)、人工氣候箱(杭州綠博儀器)、高壓滅菌鍋(上海左樂儀器有限公司)。HP20SS樹脂(日本三菱)、硅膠(200～300目，青島海浪硅膠干燥劑廠)、MCI-gel CHP20P(75～100 μm，Mitsubishi Chemical Co.,Ltd.)、Rp-18(40～60 μm，Merck)。薄層層析用預制硅膠GF-254(青島海浪硅膠干燥劑廠)。

1.3 提取與分離

稱取五爪金龍干重1.5 kg，粉碎，用乙醇浸提24 h，過濾得濾液，重復提取3次，合并濾液、濃縮，得五爪金龍乙醇提取物浸膏(325.27 g)。用甲醇溶解浸膏，然后用石油醚進行萃取，分別得到石油醚萃取層和甲醇層兩部分。甲醇層經硅膠拌樣后上硅膠柱(d=12 cm，樣品柱高1 m)，用石油醚∶丙酮按不同梯度洗脫(30∶1、20∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1)，每個梯度沖10 L，洗脫下來的餾分用薄層層析板監控，將顯色一致的部分合起來，得到8個部分：Fr.1～Fr.8。

Fr.4經HP20SS、C18柱層析和Sephadex LH-20柱層析，得到化合物1(16 mg)。Fr.5經HP20SS、C18柱層析和Sephadex LH-20柱層析，得到化合物2(11 mg)和化合物3(10 mg)。

1.4 抗菌活性測定

化合物濃度配制：分別稱取各個化合物1 mg于10 mL容量瓶中，定容，得到濃度為100 μg·mL-1的樣品。取濃度為100 μg·mL-1的樣品2 mL和1 mL，分別定容至4 mL，獲得濃度梯度為50 μg·mL-1和25 μg·mL-1的樣品。得到濃度分別為100、50、25 μg·mL-1的溶液。

培養基配制(PDA)：稱取去皮的土豆300 g，切碎加水400 mL蒸煮30 min，用紗布過濾得澄清濾液，加入葡萄糖、瓊脂粉各30 g，攪拌至充分溶解，定容至1 500 mL，置于高壓滅菌鍋中滅菌30 min，待用。

抑菌試驗：將滅菌后的培養基倒入培養皿中，冷卻，待用。將配制好的濃度為100、50、25 μg·mL-1樣品用0.2 μm濾膜過濾，分別取過濾后的樣品200 μL均勻涂到培養基上，每個濃度設置3個重復作為處理組，以均勻涂布200 μL甲醇的培養基作為對照。用打孔器將香蕉枯萎病病原菌的菌餅打成直徑0.5 cm的圓餅，將病原菌分別接到涂有單體化合物和甲醇的培養基上，封口，置于28℃、濕度RH為60%的培養箱中培養5 d，每日觀察1次，觀察病原菌生長情況，并拍照、記錄數據。

抑制率(%)=(r1-r2)/r1×100

式中，r1為對照培養基菌絲半徑(cm)，r2為50 μg·mL-1濃度培養基菌絲半徑(cm)。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

化合物1為淡黃色針晶。從碳譜13C-NMR和DEPT譜上可以看出，化合物含有10個碳，包括1個甲氧基、4個次甲基和5個季碳。在13C-NMR譜圖上，化學位移為δC∶161.8處的峰，表明化合物1中含1個酯羰基。1H-NMR譜圖顯示4個烯氫δH：6.22、6.83、7.01、7.84。上述信息表明化合物1為香豆素類化合物，與文獻[21]數據比較確定化合物1為東莨菪亭內酯(圖1)。

圖1 化合物1結構圖

化合物1核磁數據為1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ：6.22 (1H,d,J=9.0 Hz,H-3),7.84(1H,d,J=9.0 Hz,H-4),6.83(1H,s,H-5),7.01(1H,s,H-8),3.83(3H, s, H-11)·13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ：161.8(C-2),113.4(C-3),143.5(C-4),110.2(C-5),145.9(C-6),145.3(C-7),102.7(C-8),111.8(C-9),149.6(C-10),56.1(C-11)。

化合物2為白色針晶，分子式為C7H6O5；化合物2核磁數據為1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δ：6.88(2H,s,H-2/6),8.81(1H,s,HO-4),9.09(2H,s,HO-3/5),12.20(1H,s,-COOH).13C-NMR (CD3OD,150 MHz )δ：119.8(C-1),108.9(C-2),144.9(C-3),137.9(C-4),153.8(C-5),108.5(C-6),167.2(-COOH)。以上數據與文獻[22]報道數據一致，確定化合物2為沒食子酸。

化合物3為無色針狀晶體，與實驗室分離得到β-谷甾醇對照品用相同溶劑系統進行薄層鑒別，發現二者Rf值相同，確定化合物3為β-谷甾醇。

2.2 抑菌活性測試結果

抑菌活性測定5 d后觀察鐮刀菌生長情況，發現東莨菪亭內酯(化合物1)在50 μg·mL-1的濃度下可以明顯抑制香蕉枯萎病病原菌的生長(圖2)，在100 μg·mL-1和25 μg·mL-1的濃度下對香蕉枯萎病病原菌的生長沒有影響。沒食子酸(化合物2)和β-谷甾醇(化合物3)對香蕉枯萎病病原菌的生長無明顯影響。

注：處理組為培養基表面涂抹200 μL單體化合物，對照組為培養基表面涂抹200 μL甲醇

3 結論與討論

本研究從入侵植物五爪金龍乙醇提取物中分離鑒定出3個單體化合物，其中東莨菪亭內酯(化合物1)在50 μg·mL-1濃度下對香蕉枯萎病病原菌的生長具有很好地抑制效果，有望開發成環境友好型的植物源生物農藥，用于香蕉枯萎病的防治，并且為合成新型殺菌劑提供先導化合物。前期研究表明，東莨菪亭內酯在五爪金龍莖中含量高達6 μg·g-1，對福壽螺具有很強的毒殺作用，其在50 μg·mL-1的濃度下對水稻和稗草幼苗的生長具有促進作用[23]。

傳統上認為五爪金龍為入侵雜草，為有害植物。本研究結果發現五爪金龍次生代謝產物具有抗作物病原菌的功能，研究結果可為五爪金龍的開發和應用提供理論依據，并為香蕉枯萎病以及由尖孢鐮刀菌所引起的其他農作物病害的防治提供了新的策略。香蕉枯萎病為土傳病害，五爪金龍根系分泌物中是否含有東莨菪亭內酯以及其在根系分泌物中的含量、五爪金龍與香蕉間作是否能減輕香蕉枯萎病的發病率等問題仍有待于進一步研究。