高效液相色譜法測定中果酒中山梨酸含量的不確定度評定

在防腐保鮮劑中，山梨酸具有高效性和安全性，這是得到國際社會共同認可的[1]。其作用機理是通過降低食品中微生物脫氫酶的活性抑制微生物的生長和繁殖，廣泛應用于多種行業[2]。因此，對食品中的山梨酸的定性和定量檢測在保障食品安全方面至關重要[3-5]。本研究采用GB 5009.28—2016方法測定果酒中山梨酸的含量，并依據JJF 1059.1—2012對實驗過程中各分量所產生的不確定度進行評估計算。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果酒來自食品安全監督隨機抽樣樣本；乙酸銨：致遠化學試劑有限公司（天津）；甲醇：Merck公司（德國）；水中山梨酸（1.00 mg·mL-1）：北京壇墨質檢科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-2030C 3D高效液相色譜儀：日本島津；MS205DU電子天平：瑞士Mettler-Toledo。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取約2 g果酒于50 mL容量瓶中，用純化水定容至刻度，混勻，取上清液經0.45 μm濾膜過濾，按照液相色譜儀操作進樣測定。

標準溶液配制：準確量取山梨酸標準品5.0 mL于10 mL容量瓶，用水定容至刻度得到500 μg·mL-1的中間儲備液。精密吸取山梨酸中間溶液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL和1.00 mL于10 mL容量瓶，用超純水定容至刻度，配制成質量濃度分別為5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1和 50 μg·mL-1的標準曲線溶液。

果酒中山梨酸含量測定：樣液由液相色譜儀進行峰面積測定，根據標準工作曲線計算得到果酒中山梨酸的質量濃度。

1.3.2 建立數學模型

按照以上試驗操作，建立果酒中山梨酸的含量不確定度數學模型為

式中：X為果酒中山梨酸含量，g·kg-1；C為由標準曲線計算出果酒待測樣液的濃度，μg·mL-1；V為稀釋后的試樣體積；m為果酒質量，g；1 000為單位換算因子。

2 結果與分析

2.1 確定不確定度的來源

從樣品前處理、液相色譜測定以及數學模型可知，測定果酒中山梨酸含量不確定度主要來源于標準溶液引入urel(std)、校準曲線建立引入urel(S)、實驗前處理引入urel(P)和樣品重復性測量引入urel(R)。

2.2 不確定度分量因素的量化計算

2.2.1 標準物質引入的不確定度urel(std)

本實驗采用的標準品為水中山梨酸，濃度為1.00 mg·mL-1，擴展不確定度為±1%（k=2）。則山梨酸標準品引入的不確定度為

2.2.2 配制標準溶液和建立校正曲線引入的相對不確定度urel(S)

（1）由配制標準中間工作液引入的不確定度urel(S1)。①5 mL刻度吸管引入的相對不確定度urel(S1-1)。規定5 mL刻度吸管（A級）容量允差為±0.025 mL，采用B類評定方法，取矩形分布，則

②定容至10 mL容量瓶引入的相對不確定度urel(S1-2)。則

③溫度變化引入的相對不確定度urel(S1-3)。實驗室溫度控制在20 ℃±5 ℃，此溫度下玻璃膨脹系數為2.5×10-5/℃，水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃。取均勻分布計算

合并以上分量相對不確定度，則由配制中間標準溶液過程引入的相對標準不確定度為

（2）標準中間工作溶液稀釋成系列標準工作曲線引入的不確定度urel(S2)。吸取標準中間工作溶液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL和1.00 mL于10 mL容量瓶中，引入的不確定度如下。配制標準曲線使用了0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL刻度吸管，依照相關規程JJG 196—2006、JJG 646—2006規定，按均勻分布并取矩形分布，采取B類評定方法，則由刻度吸管引入的相對標準不確定度urel(S2-1)為

吸取的標準中間工作液定容于10 mL容量瓶，引入的不確定度主要是容量瓶定容引入u(S2-2)和溫度變化引入u(S2-3)。依照相關規程JJG 646—2006和JJG 196—2006的規定，10 mL容量瓶最大允差±0.020 mL，按照B類評定方法，取矩形分布，則按照均勻分布計算，則

合并以上分量相對不確定度，則由標準中間溶液配制成標準工作曲線引入的相對不確定度為

（3）建立校準曲線引入的不確定度urel(S3)。5個不同濃度標準工作溶液對應的峰面積見表1，結合校準曲線為y=a+bx和最小二乘法擬合，得出a=-1 599.87，b=60 292.79，在下列各式中視為常數。

表1 標準工作液與樣品測得結果表

根據公式（2）、（3）計算校準曲線引入的不確定度urel(S3)為

式中：xpredi為測定山梨酸含量引入的不確定度；S為由擬合直線求得與相應yi測定值之差按貝塞爾公式求出的殘余標準誤差；p為樣品溶液測定次數；n為標準溶液測定次數；為山梨酸濃度平均值，μg·mL-1；為山梨酸標準溶液濃度平均值，μg·mL-1。

將表1中各數據代入公式（2）、（3），計算得S=13 483.51，u(S3)=0.144 μg·mL-1，則校準曲線引入的不確定度為

合并以上分量，由建立標準曲線引入的不確定度為

2.2.3 試樣前處理引入的不確定度urel(P)

（1）試樣稱樣引入的不確定度urel(P1)。稱量樣品使用的天平（MS205DU），不確定度為U=0.02 mg，k=2，由此引入的不確定度為u(P1)=0.000 02/2=1.000×10-5g；由稱取果酒樣品為2.000 g引入的相對標準不確定度為urel(P1)=u(P1)/2.000=5×10-6。

（2）由定容體積引入的不確定度urel(P2)。樣品處理后用50 mL的A級容量瓶定容，參照《常用玻璃量具檢定規程》，其最大允許誤±0.05 mL，采用B類評定方式，考慮由矩形分布引入的不確定度為則定容的相對標準不確定度為urel(P2)=u(P2)/50=5.78×10-4。

（3）溫度變化引入的樣品定容不確定度urel(P3)。根據均勻分布則50 mL容量瓶的溫度波動引入的標準不確定度為u(P3)=50×(2.1×10-4-2.5×10-5)×則相對標準不確定度為urel(P3)=u(P3)/50=5.34×10-4。

合并以上分量，由試樣前處理引入的不確定度為

2.2.4 試樣測定結果重復性的不確定度urel(R)

本實驗考察了儀器測試穩定性，對同一樣品重復測量5次，所得結果分別為 0.515 0 g·kg-1、0.515 0 g·kg-1、0.510 3 g·kg-1、0.512 9 g·kg-1和 0.517 7 g·kg-1。采用 A類評定，應用貝塞爾法計算，則重復測量同一樣品量引入的標準不確定度為

2.3 擴展不確定度計算（U）及結果報告

綜合以上結果，根據影響本測定實驗不確定度urel(std)、urel(S)、urel(P)、urel(R)的各分量合成計算，得出果酒中山梨酸含量測定的相對不確定度urel(T)為

試樣中山梨酸含量的算術平均值為0.514 0 g·kg-1，則標準不確定度為urel(t)=urel(T)×0.514 0=0.010 4 g·kg-1。

取包含因子k=2得出擴展不確定度為

因此，在置信概率P=95%（k=2）時，本實驗果酒中山梨酸含量的測定不確定報告為X=(0.514 0±0.020 8) g·kg-1，k=2。

3 結論

本研究對高效液相色譜法測定果酒中山梨酸所引入的不確定度各分量進行分析和合成，結論得出配制標準工作溶液引入的不確定度貢獻率最大（87.7%）。針對以上數據，為有效提高測定結果的準確性，關鍵控制點在于減少建立校正曲線時配制系列工作曲線引入的誤差，所以需要減少小體積的移取偏差，可以通過將刻度吸管換為更精準的進口移液器，減小允差，同時使用高精度的量具來減小引入的不確定度，定期維護和檢定移液槍和量具。此數學模型可為其他液相色譜測定酒類添加劑不確定度研究提供參考。