液相色譜串聯質譜法測定玉米中伏馬毒素的不確定度評定

伏馬毒素是鐮刀菌在環境條件影響下產生的水溶性有毒次級代謝物，已發現的伏馬毒素有30多種，包括FB1、FB2、FB3等，毒性最大的是FB1[1]。玉米在種植、收獲、加工、運輸和儲存等過程易發生伏馬毒素感染現象。范楷等[2]對長三角地區農產品進行分析，發現FB1、FB2、FB3的檢出率為49.0%、35.7%、29.3%。伏馬毒素污染的糧食進入食物鏈后，會對人的身體健康產生嚴重影響[3]。許多國家和組織制定了食品中多種伏馬毒素的限量標準[4]。我國食品中伏馬毒素的限量標準還未正式頒布，因而對伏馬毒素的研究具有重要意義[5]。本研究實驗檢測方法基于同位素稀釋的高效液相色譜-串聯質譜法，能夠快速提取伏馬毒素，提取效率和靈敏度高。

檢測方法的測量不確定度是對結果準確性的評估，受到各類實驗室的廣泛重視[6]。測量不確定度是指由于測量誤差的存在，對被測量值不能確定的程度，其對于評判檢測方法的科學性及準確性具有重要意義[7]。有研究基于液相色譜串聯質譜法檢測玉米粉中伏馬毒素B1的不確定度評定，但檢測方法缺少FB2和FB3，因此不確定度的評定不夠完全。本實驗依據標準規定的評估方法和程序，對同位素稀釋高效液相色譜-串聯質譜法測定玉米中FB1、FB2、FB3進行不確定度的評定，以提高檢測結果的準確性，為實驗室質量控制提供嚴謹的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用玉米樣品購于當地農貿市場；甲醇、乙腈，色譜純，sigma公司；甲酸，色譜純，霍尼韋爾公司；甲酸98%，國藥化學試劑公司；伏馬毒素B1（50 μg·mL-1）、伏馬毒素 B2（50 μg·mL-1）、伏馬毒素B3（50 μg·mL-1）、13C伏馬毒素混合標準液（U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2，均為 5 μg·mL-1）、13C 伏馬毒素B3(U-[13C34]-FB3，10.02 μg·mL-1），Romer公司。

LC-30AD高效液相色譜儀，島津公司；AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿質譜儀，AB Sciex公司；Allegra 64R臺式高速離心機，貝克曼公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀，同泰聯公司；Mili-Q超純水機，Millipore公司；Dragon Lab QL902渦旋振蕩器，Dragon Lab公司；SB-3200DTDN超聲波清洗器，新芝生物科技公司。

1.2 實驗方法

實驗方法及儀器條件均為實驗室自建，符合實驗室檢測要求。

1.2.1 標準溶液的配制

（1）外標標準溶液的配制。分別移取伏馬毒素儲備液 100 μL加 900 μL乙腈∶水（80∶ 20，V/V）稀釋成5 μg·mL-1的標準中間工作液；分別移取40 μL伏馬毒素標準中間工作液于5 mL容量瓶中，加入適量乙腈∶水（80∶20，V/V）溶液定容，配制成質量濃度均為40 μg·L-1的混合外標標準中間工作溶液，利用逐級稀釋的方法，用流動相稀釋得到一系列濃度為2 μg·L-1、4 μg·L-1、8 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1和80 μg·L-1的標準工作溶液。

（2）內標標準溶液的配制。分別移取40 μL（U-[13C34]-FB1、U-[13C34]-FB2）伏馬毒素混合標準液和20 μL U-[13C34]-FB3溶液于5 mL容量瓶中，加入適量乙腈∶水（80∶20，V/V）溶液，配制成質量濃度為40 μg·L-1穩定同位素內標標準中間工作液。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取2.00 g樣品（精確至0.1 mg）于50 mL離心管中，加入50 μL的內標標準中間工作液渦旋1 min，再加入10 mL乙腈∶水∶甲酸（80∶18∶2，V∶V∶V）溶液，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min；在 4 ℃下 8 000 r·min-1離心 10 min；取 5 mL 上清液在40 ℃水浴下氮氣吹干，加入500 μL甲醇∶水∶甲酸（30∶70∶0.1，V∶V∶V）溶液，渦旋振蕩1 min，超聲 5 min，12 000 r·min-1離心 10 min，取上層清液上機待測。

1.2.3 儀器條件

（1）液相條件。色譜柱：Shiseido-C18（100 mm×2.0 mm×3 μm）；進樣體積為 10 μL；流速 0.3 mL·min-1；流動相A：0.1%甲酸/水溶液，流動相B；甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～1 min 30% B，1.0～6.5 min 30%→55% B，6.5～8.5 min 55% B，8.5～10.0 min 55%→80% B，10～12 min 80% B，12.0～12.1 min 80%→30% B，12.1～16.0 min 30% B。

（2）質譜條件。電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度：550 ℃；離子噴霧電壓：5 500 V（正模式）；氣簾氣：35 psi；氣體1：50 psi；氣體2：55 psi；采用多反應監測（MRM）模式進行檢測，質譜參數見表1。

表1 質譜條件參數表

1.2.4 含量計算

伏馬毒素含量計算公式為

式中：Xi為樣品中伏馬毒素的含量，μg·kg-1；Ci為從標準曲線所得測定液中伏馬毒素的濃度，μg·L-1；V為試樣的定容體積，mL；m為試樣的稱樣量，g；D為稀釋倍數，D=2；為回收率校正因子。

2 結果與分析

在實驗過程中，測量不確定度的來源主要有標準溶液的配制、前處理實驗過程、標準曲線的擬合、重復性實驗和加標回收率實驗。

2.1 標準溶液的配制引入的不確定度

2.1.1 標準儲備液純度引入的不確定度

伏馬毒素標準儲備液純度引入的不確定度結果見表2。

表2 標準儲備液純度引入的不確定度表

2.1.2 配制標準工作液引入的不確定度

將 50 μg·mL-1伏 馬 毒 素 混 合 儲 備 液 稀 釋 到5 μg·mL-1。依據檢定規程，配制過程中使用5 mL單標線容量瓶2次（矩形分布）；5 mL移液槍3次，1 mL移液槍3次，100 μL移液槍6次（三角分布），引入的不確定度見表3。

由于同位素內標濃度不參與結果計算。因此，配制標準工作液引入的合成相對標準不確定度為

表3 使用器具引入的不確定度表

2.1.3 溫度引入的不確定度

實驗室溫度為（20±5）℃。標準中間工作液用乙腈定容，室溫20 ℃其膨脹系數為1.37×10-3/℃。依據矩形分布，相對標準不確定度為

2.2 前處理引入的不確定度

2.2.1 稱量引入的不確定度

天平校準鑒定證書給定誤差0.5 mg，準確稱量2.00 g時，相對標準不確定度為

2.2.2 量取提取液引入的不確定度

樣品提取時，使用10 mL移液槍準確量取乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2溶液，根據校準證書，20 ℃時允差為0.14%，標準不確定度（三角分布）為樣品提取后，5 mL移液槍量取5 mL上清液氮吹，20 ℃時允差為0.15%，標準不確定度（三角分布）為則量取提取液時引入的相對標準不確定度為

2.3 標準曲線擬合引入的不確定度

配制濃度為 2 μg·L-1、4 μg·L-1、8 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1和 80 μg·L-1的標準溶液。以濃度為橫坐標，峰面積比為縱坐標，標準曲線方程和線性相關系數r2由最小二乘法線性擬合得到，具體結果見表4。

表4 擬合標準曲線表

擬合的標準曲線作為定量標準。儀器測量值與理論計算值的標準偏差為

標準溶液殘差平方和為

標準曲線擬合產生的不確定度為

式中：SR為標準曲線Y與相應Yi的回歸剩余標準差；p為樣品溶液測定總次數，p=6；m為標準溶液的測定總次數，m=6；a為回歸系數；X為樣品中含伏馬毒素含量，μg·L-1；c-為標準溶液中伏馬毒素平均值，μg·L-1；ci為各標準溶液中伏馬毒素量，μg·L-1；yi為標準溶液各點峰面積/內標峰面積；y為標準溶液各點峰面積/內標峰面積的回歸值；b為回歸系數。

表5 標準曲線擬合引入的不確定度結果表

2.4 重復性實驗引入的不確定度

表6 樣品重復測定檢測及不確定度結果表

2.5 加標回收引入的不確定度

空白玉米樣品加入4 g·L-1的標準溶液進行6次加標回收實驗。加標回收引入的相對標準不確定度為對平均加標回收率進行顯著性檢驗，確定平均加標回收率與期望值1是否存在顯著性差異，并用t檢驗表示。自由度f=n-1=5，查t值臨界值分布表，t值均大于雙側臨界值t(0.05,5)=2.571，表示結果存在顯著性差異，用回收率校正因子修正。伏馬毒素的回收率和不確定度結果見表7。

表7 伏馬毒素的回收率和不確定度結果表

2.6 合成標準不確定度與擴展不確定度

合成標準不確定度為

根據JJF 1059.1—2012，置信水平為95%時，包含因子k=2，擴展不確定度為U(X)=k×X×urel(X)，3種伏馬毒素的擴展不確定度及檢測結果見表8。

表8 伏馬毒素的檢測結果表

3 結論

本實驗綜合考慮各因素，發現在檢測過程中，標準曲線擬合引入的相對不確定度最小，標準溶液的配制過程中引入的相對不確定度最大。因此在實驗中，配制標準溶液時需遵守操作步驟，移液槍、液相色譜、質譜等設備進行定期維護檢修，保持高靈敏度，定期檢定校準，提高準確性。