改良考馬斯亮藍(lán)試劑法測定殼聚糖及其 衍生物中蛋白質(zhì)含量

殼聚糖（Chitosan，CTS）是由甲殼素經(jīng)脫乙?；瞥傻囊环N聚陽離子大分子天然多糖，其安全無毒，可生物降解，具有良好的生物相容性，無免疫原性，具有抑菌[2]、消炎、止血[3]、鎮(zhèn)痛[4]及促進(jìn)傷口愈合等生物學(xué)功能。近年來國內(nèi)外以殼聚糖為基礎(chǔ)原材料的生物醫(yī)用材料相關(guān)研究非?；钴S，已成為多糖生物醫(yī)用材料研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

殼聚糖主要來源于蝦蟹殼，在制備純化過程中雖然經(jīng)強(qiáng)酸、濃堿反復(fù)處理[5]以除去大部分無機(jī)物和蛋白質(zhì)等，但仍會有少量的蛋白質(zhì)殘留，因此殼聚糖及其衍生物應(yīng)用于生物材料方面，檢測控制其中的微量蛋白質(zhì)含量對材料的安全性是非常必要的。

Folin-酚試劑法（Lowry法）和考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）是測定微量蛋白質(zhì)常用的方法，靈敏度高，操作方便，應(yīng)用廣泛[1]。在測定殼聚糖及其帶聚陽離子電荷的衍生物中的蛋白質(zhì)含量時(shí)，Lowry法反應(yīng)條件是在堿性和中性條件下進(jìn)行，由于殼聚糖的水不溶性，殼聚糖衍生物如羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl Chitosan，CM-CTS）、羥丙基殼聚糖（Chydroxypropyl Chitosan，HP-CTS）、羥乙基殼聚糖（Hydroxyethyl Chitosan，HE-CTS）等在偏堿性和中性pH條件下所帶的-NH2/-NH3+可與Lowry試劑中的Cu2+離子結(jié)合而形成大量的絮狀沉淀，故該法不適用于殼聚糖及其衍生物中蛋白質(zhì)含量測定；Bradford法是在酸性條件進(jìn)行的，所以殼聚糖以及殼聚糖衍生物如羧甲基殼聚糖、羥丙基殼聚糖、羥乙基殼聚糖等均可在此條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。但Bradford法試劑中含有多價(jià)負(fù)電荷的磷酸，能與殼聚糖及殼聚糖衍生物中的-NH2/-NH3+產(chǎn)生不溶性絮狀沉淀，干擾了考馬斯亮藍(lán)試劑測定這類多糖中蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。在大量實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，對Bradford法中的試劑進(jìn)行了改良，將試劑中的磷酸改為鹽酸。通過方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明改良后的考馬斯亮藍(lán)試劑用于測定殼聚糖及其衍生物中可溶性蛋白含量，方法靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作方便，是一種適合于殼聚糖及其衍生物中微量蛋白含量測定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250，Sigma公司產(chǎn)品；殼聚糖（CTS）、羧甲基殼聚糖（CM-CTS）、羥丙基殼聚糖（HP-CTS），由青島博益特生物材料有限公司制備并純化；其他試劑均為國產(chǎn)商品試劑分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1800s紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；AL-104電子精密天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）50.0 mg，置100 mL容量瓶中，加水至刻度定容，配制成500 μg·mL-1的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取該標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液20 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度定容，配制成100 μg·mL-1的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前配制，4 ℃放置。

（2）殼聚糖樣品溶液。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的殼聚糖0.5 g，置50 mL容量瓶中，加水充分懸浮，加冰乙酸0.5 mL振搖充分溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成10 mg·mL-1的溶液，4 ℃下保存，一周內(nèi)使用。

（3）羧甲基殼聚糖樣品溶液。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的羧甲基殼聚糖0.5 g，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成10 mg·mL-1的溶液，4 ℃下保存，一周內(nèi)使用。

（4）羥丙基殼聚糖樣品溶液。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的羥丙基殼聚糖0.5 g，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成10 mg·mL-1的溶液，4 ℃下保存，一周內(nèi)使用。

（5）經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)G-250試劑。稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%的乙醇中后，再加入100 mL 85%的磷酸，用水稀釋到1 000 mL，過濾后備用。

（6）改良考馬斯亮藍(lán)G-250試劑。稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%的乙醇中后，再加入50 mL濃鹽酸，用水稀釋到1 000 mL，放置過夜，過濾后備用。

1.3.2 經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)試劑測定殼聚糖及其衍生物的蛋白質(zhì)含量的方法

在潔凈試管中分別依次加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足至1.0 mL進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的取樣點(diǎn)應(yīng)不低于5個(gè)；另取一個(gè)試管中加水1.0 mL作為空白對照；另取潔凈試管加入樣品溶液1.0 mL，平行樣品應(yīng)不少于3個(gè)；各加入考馬斯亮藍(lán)試劑5.0 mL，每管加畢后立即在旋渦混合器上混勻。混勻放置10 min后，在紫外可見光分光光度計(jì)上595 nm處測定相應(yīng)光吸收值，以加水管為空白對照。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)管吸光值A(chǔ)595nm為縱坐標(biāo)，作圖，即得蛋白質(zhì)含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定殼聚糖及其衍生物的蛋白質(zhì)含量的方法

在潔凈試管中分別依次加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足至1.0 mL進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的取樣點(diǎn)應(yīng)不低于5個(gè)；另取一個(gè)試管中加水1.0 mL作為空白對照；另取潔凈試管加入樣品溶液1.0 mL，平行樣品應(yīng)不少于3個(gè)，各加入改良考馬斯亮藍(lán)試劑5.0 mL，每管加畢后立即在旋渦混合器上混勻?；靹蚍胖?0 min后，在紫外可見光分光光度計(jì)上（597±1）nm處測定相應(yīng)光吸收值，以加水管為空白對照。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)管吸光值A(chǔ)595nm為縱坐標(biāo)，作圖，即得蛋白質(zhì)含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.4 不同酸對考馬斯亮藍(lán)試劑pH值、顏色和最大光吸收值的影響

考馬斯亮藍(lán)染料G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，染料的最大峰的位置發(fā)生變化，據(jù)此實(shí)驗(yàn)采用了磷酸、冰醋酸、鹽酸，分別配制考馬斯亮藍(lán)試劑，考察不同酸對考馬斯亮藍(lán)試劑的pH值、溶液顏色及最大光吸收值的影響，用于考察不同酸配制的考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白質(zhì)含量的可行性。

1.5 考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白質(zhì)含量穩(wěn)定性考察

采用磷酸和鹽酸分別配制考馬斯亮藍(lán)試劑，對兩種試劑測定蛋白質(zhì)的靈敏度和穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

1.6 改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白質(zhì)含量的線性范圍考察

采用經(jīng)典和改良的考馬斯亮藍(lán)兩種試劑分別測定不同蛋白質(zhì)含量與最大吸光值（OD值）的線性關(guān)系，以評價(jià)改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白質(zhì)含量的可行性。

1.7 改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白質(zhì)含量回收率實(shí)驗(yàn)

取20支試管，編號0～20，其中0～5號分別加入不同量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足至1 mL，6～14號管分別加入不同量的已知蛋白含量的HP-CTS溶液，用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液補(bǔ)足至1 mL，15～20號管分別加入不同量的已知濃度的蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足至1 mL，按照改良考馬斯亮藍(lán)試劑蛋白質(zhì)含量測定方法測定6～20管中的蛋白質(zhì)濃度，測得蛋白質(zhì)含量與理論上已知的蛋白質(zhì)含量相比較，計(jì)算改良考馬斯亮藍(lán)試劑法測定蛋白質(zhì)含量的回收率。

1.8 改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白含量的最低檢測限實(shí)驗(yàn)

將25.8 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液稀釋10倍，在紫外分光光度計(jì)上測定，以評價(jià)改良法測定蛋白質(zhì)的最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酸對考馬斯亮藍(lán)試劑pH值、顏色和最大光吸收值的影響

經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)試劑的配制含有85%磷酸，該溶液的顏色為棕黑色，pH為0.58，最大光吸收峰在465 nm，與蛋白質(zhì)反應(yīng)后溶液的顏色變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收峰移至595 nm。在考馬斯亮藍(lán)G250試劑用于測定殼聚糖及其衍生物中的蛋白質(zhì)含量時(shí)，考慮到實(shí)際中的磷酸為三價(jià)強(qiáng)酸，可與具有-NH2/-NH3+的殼聚糖及殼聚糖衍生物產(chǎn)生正負(fù)電荷的結(jié)合，從而導(dǎo)致殼聚糖及殼聚糖衍生物大分子內(nèi)或大分子間的絮凝，干擾了溶液的透明度，干擾了測定結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)選用了3種酸按比例配制考馬斯亮藍(lán)試劑，測定殼聚糖及其衍生物中的蛋白質(zhì)含量。由表1可知，加入30～50 mL的鹽酸后，試劑最大光吸收峰在465 nm附近，與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)后其最大光吸收值為（597±1）nm，符合考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白質(zhì)含量的基本要求。

表1 不同酸的考馬斯亮藍(lán)試劑的性質(zhì)表

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2、表3可知，經(jīng)典法和改良法兩種試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)后，溶液隨時(shí)間延長其吸收值均相應(yīng)下降，但20 min內(nèi)均有很好的穩(wěn)定性。對比40 mL、50 mL兩種濃鹽酸的加入量，加入50 mL濃鹽酸的改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定殼聚糖及其衍生物蛋白質(zhì)含量時(shí)，溶液在20 min內(nèi)穩(wěn)定性更好。因此，選擇加入50 mL的濃鹽酸作為改良考馬斯亮藍(lán)試劑的配制方法，用于測定殼聚糖及其衍生物的蛋白質(zhì)含量。

表2 經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)試劑與蛋白質(zhì)形成溶液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 加入不同鹽酸量的考馬斯亮藍(lán)試劑與蛋白質(zhì)形成溶液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3 線性范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)典和改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的結(jié)果見表4，兩種試劑測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液曲線見圖1、圖2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，改良的考馬斯亮藍(lán)試劑與經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白質(zhì)含量的線性數(shù)據(jù)基本一致，在0～104.0 μg·mL-1蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與光吸收均呈線性關(guān)系，R2分別可達(dá)到 0.994 4和 0.994 1。

表4 經(jīng)典和改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的結(jié)果比較表

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)試劑測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，羥丙基殼聚糖（HP-CTS）受干擾最大，因此本實(shí)驗(yàn)以蛋白質(zhì)殘留為陰性的HP-CTS為實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。由表5可知，回收率結(jié)果平均值為118.74%，表明用改良的考馬斯亮藍(lán)試劑測定殼聚糖及殼聚糖衍生物中微量蛋白質(zhì)含量，回收率比較好。

圖1 經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)試劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 改良考馬斯亮藍(lán)試劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表5 改良法測定蛋白含量回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.5 最低檢測限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在蛋白質(zhì)濃度為1.032 μg·mL-1時(shí)，改良試劑與蛋白質(zhì)溶液反應(yīng)后在（597±1）nm處仍有吸收，最低檢測限約為 1 μg·mL-1。

2.6 經(jīng)典和改良的考馬斯亮藍(lán)試劑測定CTS、CMCTS、HP-CTS中的蛋白質(zhì)含量的比較

采用兩種測定試劑分別對CTS溶液、CM-CTS溶液、HP-CTS溶液中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表6。

表6 經(jīng)典和改良考馬斯亮藍(lán)試劑測定CTS、CM-CTS、HP-CTS中蛋白質(zhì)含量的結(jié)果表

由表6可知，經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)試劑測定殼聚糖及其衍生物樣品，殼聚糖及羥丙基殼聚糖溶液中呈現(xiàn)藍(lán)色的細(xì)小懸浮顆粒，在沉淀不能去除的情況下測定OD值偏高；羧甲基殼聚糖溶液中多為藍(lán)色絮狀顆粒，顆粒沉降后的上清液測定OD值反而偏低。而改良的考馬斯亮藍(lán)試劑測定上述樣品，檢測液為澄清溶液。經(jīng)典試劑中的多價(jià)磷酸可與殼聚糖及其衍生物的-NH2/-NH3+結(jié)合，產(chǎn)生不溶性的絮凝，溶液中形成大量藍(lán)色的顆粒狀或絮狀沉淀，若沉淀懸浮在溶液中，測定的結(jié)果偏高，若沉淀沉降后，測定的結(jié)果又偏低，而采用改良后的考馬斯亮藍(lán)試劑測定同一份溶液的蛋白質(zhì)含量時(shí)，溶液澄清透明，原因是消除了沉淀的干擾，測定結(jié)果可信。

3 結(jié)論

在測定殼聚糖及其衍生物中蛋白質(zhì)含量時(shí)，由于殼聚糖及殼聚糖衍生物本身含有-NH2/-NH3+，能與加入磷酸的經(jīng)典考馬斯亮藍(lán)試劑發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生絮狀沉淀，干擾了測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，在配制考馬斯亮藍(lán)試劑時(shí)用50 mL的濃鹽酸代替磷酸，配制的考馬斯亮藍(lán)試劑與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物在20 min內(nèi)穩(wěn)定，線性R2可達(dá)到0.994 1，回收率為118.74%，最低檢測限可達(dá)到1 μg·mL-1。在測定殼聚糖及殼聚糖衍生物中蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)中，溶液澄清透明，測定的結(jié)果可信。