驅(qū)動蛋白家族成員15在非特殊型浸潤性乳腺癌中的表達及意義

王枝紅，劉紅，何楠，鄧柳婭

(貴州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 乳腺外科，貴州 貴陽 550003)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為45歲以下女性惡性腫瘤死亡原因的首位。2018年全球新確診乳腺癌病例大約209萬，死亡人數(shù)大約63萬[1]。非特殊型浸潤性乳腺癌(invasive carcinoma of no special type，IC- NST)是最常見的浸潤性乳腺癌類型，占40%～75%[2]。乳腺癌的生物學機制尚未完全明確，尋找新型分子生物學標志物對其早期診治有重要意義。驅(qū)動蛋白超家族(kinesin superfamily，KIF)屬于分子馬達的一種，在細胞內(nèi)運輸、細胞形成、細胞分裂和細胞功能等方面起到重要作用[3]。KIF包含45個成員，KIF15可促進雙極紡錘體形成、質(zhì)膜運輸和細胞分裂[4]。既往研究顯示，KIF15高表達與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關，包括前列腺癌[5]、胃癌[6]和膀胱癌[7]等。KIF15在乳腺癌中的表達及臨床意義既往少有報道。為了排除特殊性浸潤性乳腺癌的一些特殊生物學行為、預后因素帶來的影響，本研究以IC- NST為研究對象。本研究采用免疫組織化學染色法檢測IC- NST組織中KIF15的表達，觀察KIF15與臨床病理特征及預后的關系，另外采用RNA干擾技術沉默乳腺癌MDA- MB- 231和MCF- 7細胞中KIF15的表達，觀察細胞增殖、侵襲、凋亡及Notch1信號通路的變化，旨在探究KIF15在IC- NST中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

正常乳腺細胞(MCF- 10A)和乳腺癌細胞(MDA- MB- 231和MCF- 7細胞)均購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于海滬震實業(yè)有限公司；質(zhì)粒由上海吉凱基因科技有限公司設計并提供；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒購于美國 Invitrogen公司；CCK- 8試劑盒、Annexin- V- FITC/PI凋亡檢測試劑盒和Transwell小室均購于美國Sigma公司；KIF15、hes1、hes5、NICD和GAPDH抗體均購于美國 Invitrogen公司。

1.2 組織樣本

選取2014年6月至2019年12月本院收治的IC- NST患者126例，年齡36～67歲，平均(52.09±5.29)歲。所有患者術前均未接受過放化療，并且未合并其他部位腫瘤。術中留取癌組織及其配對的癌旁組織(與癌組織病灶距離≥5 cm)。選取同期80例導管內(nèi)癌組織為對照，患者年齡28～59歲，平均(47.82±8.12)歲。術后對IC- NST患者進行電話和門診隨訪，隨訪至2021年1月，記錄無進展生存時間(手術至乳腺癌進展或者因任何原因致患者死亡的時間)。

1.3 免疫組化檢測組織中KIF15的表達

石蠟切片(厚度為4 μm)由本院病理科制備，在70 ℃下烤片30 min，隨后進行脫蠟處理。用Tris/EDTA修復液進行抗原修復，羊血清封閉30 min，加入鼠抗人KIF15單克隆抗體(1∶500)4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min。隨后用辣根標記的鏈霉素卵白素工作液和DAB顯色液處理，蘇木紫復染。經(jīng)過脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。細胞核染色為棕黃色視為KIF15陽性。陽性染色細胞≤10%為陰性表達，>10%為陽性表達。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將MCF- 10A、MDA- MB- 231和MCF- 7細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中進行培養(yǎng)。待細胞融合度達80%時進行傳代，取5～15代對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。將MDA- MB- 231和MCF- 7細胞分別分為NC- siRNA組和KIF15- siRNA組，分別用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染NC- siRNA和KIF15- siRNA。NC- siRNA序列：5′- GGACUCGAAGUUAGACCGAGA- 3′；KIF15- siRNA序列：5′- GGAUGAGAGACAAAGGAAGUU- 3′。轉(zhuǎn)染步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 沉默KIF15對細胞增殖、侵襲、凋亡及Notch1信號通路的影響

1.5.1 KIF15基因表達水平檢測 采用TRIzol法提取細胞中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后用實時熒光定量試劑盒進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ 30 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，用2-ΔΔCt法計算KIF15 mRNA相對表達量。

1.5.2 CCK- 8法檢測細胞增殖活力 轉(zhuǎn)染48 h后取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板。待細胞貼壁后，分別于培養(yǎng)24、48、72 h加入10 μl CCK- 8溶液，孵育2 h后用酶標儀檢測光密度(optical density，OD)值，檢測細胞增殖能力。設置5個復孔。

1.5.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 在Transwell小室的上室鋪基質(zhì)膠，隨后將細胞接種于24孔板，以2×105個·ml-1密度將細胞加入上室，每孔加量100 μl；下室中加入培養(yǎng)基，每孔加量250 μl。待細胞貼壁后更換上室培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用無菌棉簽拭去小室濾膜上的細胞，甲醛固定15 min，HE染色，光鏡下統(tǒng)計膜背面侵襲的細胞數(shù)。設置5個復孔。

1.5.4 Annexin- V- FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡 取轉(zhuǎn)染后細胞，用500 μl預冷1×結合緩沖液將其制成1×106個·ml-1的懸液。加入5 μl異硫氰基熒光素，混勻后孵育10 min。隨后加入2.5 μl碘化丙啶，孵育5 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。設置5個復孔。

1.5.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達水平 RAPI裂解液提取總蛋白，10% SDS- PAGE分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入KIF15(1∶500)、hes1(1∶1 000)、hes5(1∶1 000)、NICD(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4 ℃過夜孵育，次日用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗，封閉1 h。最后用ECL法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Image J軟件分析灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗。用COX多因素模型分析影響患者無進展生存時間的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 KIF15在組織及細胞中的表達

IC- NST癌組織中KIF15陽性表達率為70.63%(89/126)，高于導管內(nèi)癌組織[38.75%(31/80)，P<0.05]和癌旁組織[23.01%(29/126)，P<0.05]。乳腺癌MDA- MB- 231和MCF- 7細胞的KIF15蛋白表達水平分別為1.89±0.34、1.33±0.21，均高于正常乳腺細胞MCF- 10A(0.29±0.10，P<0.05)。見圖1。

A.免疫組化檢測組織中KIF15表達 ×200；B.蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中KIF15蛋白表達圖1 KIF15在組織及細胞中的表達

2.2 KIF15表達與IC- NST臨床病理特征的關系

KIF15表達與組織學分級、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關(P<0.05)，與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、手術方式、腫瘤直徑、脈管侵犯、分子分型無關(P>0.05)。見表1。

表1 KIF15表達與IC- NST臨床病理特征的關系 例

2.3 IC- NST患者無進展生存時間的單因素和COX多因素分析

單因素和COX多因素分析結果顯示，TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、KIF15表達是IC- NST患者無進展生存時間的影響因素(P<0.05)，見表2、3。

表2 IC- NST患者無進展生存的單因素分析

表3 IC- NST患者無進展生存的COX多因素分析

2.4 沉默KIF15對癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

沉默KIF15基因后MDA- MB- 231、MCF- 7細胞的KIF15 mRNA和蛋白表達水平均下降(P<0.05)，見表4。沉默KIF15基因后MDA- MB- 231、MCF- 7細胞的增殖和侵襲力均受到抑制，而凋亡水平升高(P<0.05)，見表5、6和圖2。

表4 沉默KIF15對MDA- MB- 231和MCF- 7細胞KIF15基因和蛋白表達的影響

表5 沉默KIF15對MDA- MB- 231細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

表6 沉默KIF15對MCF- 7細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

與NC- siRNA組比較，a P<0.05A.沉默KIF15對MDA- MB- 231細胞侵襲的影響；B.沉默KIF15對MDA- MB- 231細胞凋亡的影響；C.沉默KIF15對MCF- 7細胞侵襲的影響；D.沉默KIF15對MCF- 7細胞凋亡的影響圖2 沉默KIF15對癌細胞侵襲和凋亡的影響

2.5 沉默KIF15對癌細胞Notch1信號通路的影響

沉默KIF15基因后MDA- MB- 231、MCF- 7細胞的hes1、hes5、NICD蛋白表達水平均下降(P<0.05)，見表7、圖3。

表7 沉默KIF15對癌細胞Notch1信號通路蛋白表達的影響

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測Notch1信號通路蛋白表達

3 討 論

KIF在細胞內(nèi)負責沿著微管向其正極運送不同分子貨物，例如細胞器、蛋白質(zhì)和RNA等[8]。KIF15是KIF家族成員之一，是除KIF5之外的第2個四聚體紡錘體馬達[9]。KIF15與多種癌癥密切相關，例如KIF15可通過絲裂原活化蛋白激酶- 細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK- ERK)通路促進胰腺癌細胞增殖[10]，通過調(diào)控細胞周期影響肺癌細胞死亡[6]。另外，KIF15還能通過影響氧化應激促進肝癌細胞的增殖和侵襲[11]。KIF15在乳腺癌中的表達及意義既往少有報道。Song等[12]發(fā)現(xiàn)，KIF15在乳腺癌組織中高表達，并且與患者不良預后有關。本研究結果顯示，IC- NST癌組織中KIF15陽性表達率高于導管內(nèi)癌組織和癌旁組織，另外乳腺癌MDA- MB- 231和MCF- 7細胞的KIF15蛋白表達水平均高于正常乳腺細胞MCF- 10A，KIF15表達與組織學分級、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關，以上提示KIF15參與IC- NST的發(fā)生和發(fā)展。

KIF15高表達與多種癌癥的預后有關，包括肝細胞癌[13]、胃癌[6]、前列腺癌[14]和骨肉瘤[15]。Sheng等[16]發(fā)現(xiàn)，KIF15高表達與三陰性乳腺癌患者不良生存預后有關。本研究也發(fā)現(xiàn)，KIF15陽性IC- NST患者的無進展生存時間為41.027個月，低于陰性患者的54.271個月。并且KIF15表達是IC- NST患者無進展生存時間的影響因素(HR=1.562，95%CI1.200～7.298)。細胞侵襲和凋亡是影響癌癥進展的重要因素[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默KIF15基因后MDA- MB- 231和MCF- 7細胞的增殖、侵襲受到抑制，并且凋亡水平明顯升高。Notch1信號通路與乳腺癌細胞的增殖、侵襲和凋亡密切相關[18- 19]。hes1、hes5、NICD是Notch1信號通路的關鍵蛋白[20]。沉默KIF15基因后MDA- MB- 231、MCF- 7細胞的hes1、hes5、NICD蛋白表達水平均下降，提示KIF15可能通過Notch1信號通路影響乳腺癌細胞的增殖、侵襲和凋亡，但是具體的調(diào)控機制需要未來深入分析。

綜上，KIF15在IC- NST中高表達，與患者不良生存預后有關，沉默KIF15基因后乳腺癌細胞的增殖、侵襲均受到抑制，凋亡水平升高。本研究也存在一些局限性，例如未分析KIF15對IC- NST早期診斷的價值，未分析KIF15的具體作用機制；為了排除特殊性浸潤性乳腺癌的一些特殊生物學行為、預后因素帶來的影響，本研究僅以IC- NST為研究對象。未來需要進一步分析KIF15在乳腺癌中的作用機制及意義。