熒光偏振測(cè)定法在布魯氏菌病抗體檢測(cè)中的應(yīng)用

王玉恒，吉哈利，于子淇，旦增卓瑪

（1.西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠，西藏 拉薩 850000；2.西藏蓮莖生物科技有限公司，西藏 拉薩 850000）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要臨床特征的人畜共患病，以牛、羊、豬等家畜最易感染[1-2]。該病具有傳染速度快、感染范圍大等特點(diǎn)，給人類身體健康和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展帶來嚴(yán)重威脅[3-4]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。目前，布魯氏菌病的防控形勢(shì)依然十分嚴(yán)峻，前期抗體檢測(cè)是防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]。

熒光偏振抗體檢測(cè)法（FPA）是檢測(cè)布魯氏菌病抗體的常用方法[7-8]。其原理是以分子旋轉(zhuǎn)特性為基礎(chǔ)，利用熒光偏振儀測(cè)量抗原與抗體結(jié)合后的旋轉(zhuǎn)速率，從而判定血清樣品中是否含有布魯氏菌病抗體[9-10]。目前，該檢測(cè)技術(shù)備受科研者及檢疫人員關(guān)注，已廣泛應(yīng)用于藥學(xué)[11-12]、生物學(xué)[13-14]、醫(yī)學(xué)[15-16]及動(dòng)物醫(yī)學(xué)[17-18]等學(xué)科。但FPA測(cè)定法用于牦牛布魯氏菌病抗體檢測(cè)的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究利用FPA測(cè)定法對(duì)129份牦牛血清進(jìn)行布魯氏菌病抗體檢測(cè)，并與試管凝集試驗(yàn)（SAT）進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，從而分析評(píng)價(jià)FPA測(cè)定法的性能，為布魯氏菌病抗體檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 血清 選取129 份牦牛血清樣品，置于西藏蓮莖生物科技有限公司檢測(cè)中心-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 布魯氏菌病熒光偏振抗體檢測(cè)試劑盒，采購于哈爾濱平河生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20211106；試管凝集試驗(yàn)（SAT）陽性標(biāo)準(zhǔn)、陰性標(biāo)準(zhǔn)及抗原，均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)20210716。

1.1.3 主要儀器 布魯氏菌熒光偏振檢測(cè)儀（哈爾濱平河生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)LUPO），恒溫培養(yǎng)箱（上海鴻都電子科技有限公司，SHP-300），高速冷凍離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司，TGL16），微量振蕩器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，MH-2），生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，BSC-04B2），其他耗材均為國產(chǎn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 試管凝集試驗(yàn) 按照GB/T 18646-2018《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

1.2.2 熒光偏振測(cè)定法 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，取硼硅玻璃試管加入1 ml樣品稀釋液，再加入10 μl待檢牛血清樣品，充分振蕩混勻，測(cè)定樣品空白密度值；加入10 μl的FPA標(biāo)記抗原，充分振蕩混勻，測(cè)定樣品毫偏振值。在陽性標(biāo)準(zhǔn)、陰性標(biāo)準(zhǔn)成立的條件下，樣品毫偏振值＜95為陰性，96～116為可疑，＞116為陽性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Microsoft Excel 2010版軟件中四格表法（表1）對(duì)FPA測(cè)定法與SAT試驗(yàn)法的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

表1 評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)的四格表法

2 結(jié)果與分析

采用熒光偏振抗體檢測(cè)法與試管凝集試驗(yàn)對(duì)129份牦牛血清樣品進(jìn)行布氏桿菌病抗體檢測(cè)。由表2可知，試管凝集試驗(yàn)篩選出51份抗體陰性樣品和78份抗體陽性樣品，而熒光偏振抗體檢測(cè)法篩選出41份抗體陰性樣品和88份抗體陽性樣品。

表2 熒光偏振測(cè)定法檢測(cè)結(jié)果

以試管凝集試驗(yàn)數(shù)據(jù)為參照，對(duì)熒光偏振抗體檢測(cè)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析。由表3可知，熒光偏振抗體檢測(cè)法敏感性（100.00%）、特異性（80.39%）、符合率（92.25%）和約登指數(shù)（80.39%）較高，表明其診斷準(zhǔn)確性較好；陰性似然比值（0.00）和陰性預(yù)測(cè)值（100.00%）表明檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)為真陰性的概率高；陽性似然比值（5.10）和陽性預(yù)測(cè)值（88.64%）表明檢測(cè)結(jié)果陽性時(shí)存在假陽性的可能性。

表3 數(shù)據(jù)分析表

3 討論

目前，布魯氏菌病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有血清學(xué)和細(xì)菌學(xué)，但細(xì)菌學(xué)檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求條件高并存在一定安全隱患，因此布魯氏菌病常規(guī)檢測(cè)技術(shù)為凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合、沉淀反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及熒光偏振檢測(cè)方法等血清學(xué)方法[8]。2001年Nielsen和Gall根據(jù)熒光偏振原理建立了一種適用于布魯氏菌病檢測(cè)的FPA技術(shù)[9]。因FPA技術(shù)具有簡便、客觀、快速等優(yōu)點(diǎn)，得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究[10-18]。OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》將FPA技術(shù)指定為國際貿(mào)易試驗(yàn)方法，我國也將FPA技術(shù)納入《2020年國家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》。采用試管凝集試驗(yàn)和熒光偏振抗體檢測(cè)法對(duì)129份牦牛血清樣品進(jìn)行布氏桿菌病抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示試管凝集試驗(yàn)篩選出51份抗體陰性樣品和78份抗體陽性樣品，而熒光偏振抗體檢測(cè)法篩選出41份抗體陰性樣品和88份抗體陽性樣品。再根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示熒光偏振抗體檢測(cè)法的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值均為100%，符合率達(dá)90%以上，特異性和約登指數(shù)均達(dá)80%以上，與任燕斌[19]、孫翠麗[20]研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步表明熒光偏振抗體檢測(cè)法適用于牦牛血清的布魯氏菌病抗體檢測(cè)，且診斷準(zhǔn)確性較高。