布魯氏菌BP26抗原膠體金試劑盒的研制及功能初試

王婷，張正雷，孫田華，張幸子，王彩霞，席仲興，焦 磊

（蘭州生物制品研究所有限責任公司，甘肅 蘭州 730046）

布魯氏桿菌（以下簡稱布氏菌）是革蘭氏陰性胞內寄生菌[1]。布氏菌病是一種由布氏菌引起的人畜共患慢性細菌性傳染病。該病在世界各國廣泛流行，嚴重危害人類健康和畜牧業發展。因此，快速準確的診斷是控制該病的關鍵[2]。

細菌學分離培養是最可靠的布氏菌病檢測方法，是檢測布氏菌病的“金標準”[3]。但布氏菌的分離培養對實驗室要求較高，培養周期長[4]，且該方法受很多因素影響導致陽性檢出率較低，所以布氏菌病的實驗室診斷多采用免疫學方法。最常用的有試管凝集試驗（SAT）和虎紅平板凝集試驗（RBPT）[5]，兩者具有操作簡單、實驗設備簡易的優點，是我國目前常用的檢測布氏菌病的方法，缺點是結果判定主觀性較強、檢測時間長、易出現漏檢或假陽性[6]。而膠體金免疫層析法對樣本檢測量需求少、操作方便、反應時間短，適合于廣大基層現場及大量檢測樣本的快速初篩[7]。

BP26抗原是一種強免疫原性的細胞間質蛋白，以其為檢測抗原檢測布氏菌病的準確率可達90%以上[8]。本研究基于BP26抗原并采用膠體金免疫層析法研制出布氏菌病診斷試劑盒，以期用于布氏菌病的快速檢測，尤其是基層對該病的初篩。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 抗原及血清 重組布氏菌BP26抗原和兔抗BP26多抗血清均為蘭州生物制品研究所有限責任公司制備。多抗血清由抗原免疫家兔制備。

1.1.2 儀器設備 HM3035型XYZ三維劃膜噴金儀、CT300型自動裁條機均為上海金標生物科技有限公司產品，CM4000型切條系統為BIODOT產品，SORVALL RC-6 plus型離心機、Biofuge Primo R型離心機均為ThermoFisher產品，UV-2550型紫外可見分光光度計為日本島津公司產品。

1.1.3 主要試劑及材料 氯金酸（HAuCl4·3H2O）、PEG20000、檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）均為Sigma公司產品，其他試劑均為國產。硝酸纖維素膜（德國SARTORIUS UniSart CN140），吸水濾紙（Whatman），聚酯纖維膜（VL98）、PVC板、干燥劑均為國產。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備膠體金溶液 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液。配制新鮮的1%氯金酸溶液及1%檸檬酸三鈉溶液備用，在500 ml蒸餾水中加入5 ml 1%氯金酸溶液煮至沸騰，再迅速一次性加入9 ml新配制的1%檸檬酸三鈉溶液，混勻，繼續煮沸，直至溶液呈現透明的酒紅色，待冷卻，4 ℃保存備用。觀察膠體金溶液的物理性狀，采用紫外可見分光光度計在波長400～600 nm范圍內對制備的膠體金溶液進行掃描，測定其最大吸收峰值。

1.2.2 膠體金溶液標記BP26抗原的最佳標記pH確定 配制pH 6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液，每隔0.2個pH為一個結合梯度，每管先加入100 μl磷酸鹽緩沖液，再加入30 μl BP26抗原，振蕩混勻，室溫下靜置反應20 min，再加入200 μl 10% NaCl溶液終止反應，觀察顏色變化，顏色保持不變的最低pH，即為膠體金溶液標記BP26抗原的最佳標記pH。

1.2.3 膠體金溶液標記BP26抗原的最佳標記抗原量確定 準備1.5 ml離心管若干，分別加入已調整為最佳標記pH的磷酸鹽緩沖液及膠體金溶液，各管加入BP26抗原量從6 μl至44 μl，每管間隔2 μl，振蕩混勻，室溫靜置反應20 min。然后每孔加入200 μl 10% NaCl溶液，觀察顏色變化，顏色保持不變的最小抗原量，即為膠體金溶液標記BP26抗原的最佳標記抗原量。

1.2.4 金標BP26抗原的制備 用氯金酸制備0.01%膠體金溶液，用已確定為標記BP26抗原的最佳p H 的磷酸鹽緩沖液，再根據已確定的最佳標記量加入相應量的BP26抗原，用磁力攪拌器緩慢混勻，再加入0.05%的PEG20000后繼續攪拌30 min。4 ℃條件下4000 r/min離心30 m i n，棄沉淀；上清液在4 ℃條件下9500 r/min離心45 min，小心吸取沉淀，沉淀用pH 6.7的磷酸鹽緩沖液重懸，即為金標BP26抗原，4 ℃保存備用。

1.2.5 布氏菌BP26抗原膠體金試劑盒的組裝硝酸纖維素膜（NC膜）上檢測線（T線）包被BP26抗原，質控線（C線）包被兔抗BP26多抗，膠體金結合墊鋪上金標BP26抗原，將膠體金結合墊、樣品墊、包被XT線和C線的NC膜、吸水濾紙依次固定于PVC底板上，裁切成0.42 cm ×5 cm條狀，裝入特制的塑料卡盒內，再裝入有干燥劑的鋁箔袋中密封，即為用于檢測布氏菌病的膠體金檢測試劑盒。

1.2.6 膠體金試劑盒的判定方法 樣品加量為100 μl，反應時間為15 min，T線和C線均顯示紅色條帶判定為陽性；T線不顯示紅色條帶，C線顯示紅色條帶時判為陰性；C線不顯示紅色條帶判為試劑盒失效。

1.2.7 試劑盒的兔多抗血清檢測及重復性檢測 使用3批試劑盒檢測布氏菌兔抗BP26多抗血清，血清稀釋倍數為1∶10000倍，通過試驗結果判定試劑盒的靈敏度和重復性效果。

2 結果

2.1 膠體金溶液的制備

制備的膠體金溶液外觀呈酒紅色，經紫外可見分光光度計掃描發現其吸收峰在525 nm處，峰型狹窄，說明該膠體金顆粒均一，分散性好（圖1）。

圖1 膠體金溶液的紫外可見分光光度計掃描光譜圖

2.2 膠體金溶液標記BP26抗原的最佳標記pH確定

經試驗確定，最佳標記pH為6.7。

2.3 膠體金溶液標記BP26抗原的最佳標記抗原量確定

試驗測得加入BP 26 抗原最低穩定量為16 μl/0.9 ml膠體金（BP 26 抗原蛋白含量為1.24 μg/μl），則最佳標記量為20 μl。

2.4 試劑盒的兔血清檢測及重復性檢測

使用3批試劑盒檢測布氏菌兔抗BP26多抗血清，檢測結果一致，說明試劑盒的重復性良好（圖2）。

圖2 兔抗BP26多抗血清檢測結果

3 討論與結論

膠體金免疫層析技術具有便捷、特異敏感、穩定性強、對設備要求不高、肉眼即可快速判定結果等特點，特別適合基層現場的快速初篩和應用[6,9]。BP26抗原為布氏菌細胞間質蛋白，作為布氏菌病血清學檢測診斷抗原具有較好的特異性和較高的靈敏度[10]。本研究基于BP26抗原并采用雙抗原夾心法建立了布魯氏菌BP26抗原膠體金試劑盒，即將重組的布氏菌外膜蛋白BP26作為膠體金標記物，金標BP26抗原作為檢測線（T線）及抗BP26兔多克隆抗體作為質控線（C線），該檢測試劑盒操作簡便，15 min即可檢測出結果，樣本用量少，操作過程污染機會少，且成本低廉，故可作為布氏菌病的初篩方法。