優化半連續發酵工藝在阿維菌素工業化生產中的應用

程 曦，高亞琪*，劉進峰，劉麗虹，王學偉，張 力

(1.河北興柏農業科技有限公司 河北省阿維菌素生物技術重點實驗室，河北 石家莊 051530；2.石家莊市農業技術推廣中心，河北 石家莊 050000)

阿維菌素是阿維鏈霉菌經深層發酵產生的高效低毒生物殺蟲殺螨劑，在農業、畜牧業和醫藥等領域應用廣泛。在其發酵液含有的8種組分中，B1a組分的殺蟲效果最佳，是商品化阿維菌素的主要組分[1-2]，業內以B1a含量作為衡量阿維菌素發酵生產水平的主要指標。近年來，通過菌種改良、配方優化及控制參數優化來提高發酵效價，阿維菌素發酵生產水平大幅提升，特別是中國科學院微生物研究所運用合成生物學手段[3]，實現了對阿維鏈霉菌的精準定位改良，B1a發酵效價達8 g·L-1，但通過增加放罐體積來提升阿維菌素發酵生產水平的研究報道卻很少。在阿維菌素的發酵生產過程中，發酵液的黏度處于動態變化，50 h前發酵液黏稠，之后逐步稀化，總體表現為非牛頓流體性質，且隨著發酵的進行非牛頓流體性質減弱，泡沫增多[4-5]，從而影響放罐體積。統計顯示，阿維菌素發酵放罐體積較小，約為發酵罐容積的70%，比同為放線菌的恩拉霉素、慶大霉素低 5%～10%，嚴重影響阿維菌素發酵生產水平的進一步提高。

半連續發酵工藝，俗稱帶放工藝[6]，是指在分批發酵過程中放出部分含有目標產物的發酵液，隨后補入相同體積的新鮮料液繼續發酵的方法。半連續發酵工藝在醋酸[7]、乙醇[8]和乳酸[9]等初級代謝產物的工業生產中應用廣泛，在次級代謝產物青霉素的工業生產中也已成熟應用[10]，但在其它以次級代謝產物為目標產物的工業生產中應用較少。除了操作復雜及容易染菌外，更重要的原因是，微生物次級代謝對發酵環境高度敏感[11]，補入新鮮料液會影響發酵環境、稀釋生物量，進而影響發酵效率。

鑒于此，在前期研究[12]的基礎上，作者對阿維菌素半連續發酵中的補料工藝進行優化，以進一步提高阿維菌素生產水平。

1 實驗

1.1 菌種與設備

阿維鏈霉菌AV-67，河北興柏農業科技有限公司菌種保藏中心。

12 m3不銹鋼種子罐及發酵液制備罐(罐高4.20 m，罐直徑1.80 m，配備3層箭葉攪拌器，攪拌器直徑0.62 m)、120 m3碳鋼發酵罐(罐高9.22 m，罐直徑3.82 m，配備3層攪拌器，下層攪拌器HY(CD-6)為徑向流型半圓管結構，中、上層攪拌器KSX(A-315)為軸向流型半圓管結構；下層攪拌器直徑1.23 m，中、上層攪拌器直徑1.35 m；攪拌器間距2.55 m)，江蘇揚州永鋒工業設備安裝有限公司。

1.2 培養基與培養條件

(1)12 m3種子罐培養基(g·L-1)：淀粉25，黃豆餅粉8，酵母粉3，花生粉8，酵母膏3，氯化鈷0.02；消后體積8～9 m3。培養條件：溫度27～29 ℃，空氣流速350～550 m3·h-1，培養時間45～55 h。

(2)120 m3發酵罐培養基(g·L-1)：黃豆餅粉25，玉米漿3，淀粉172，酵母粉10，輕質碳酸鈣1.6，硫酸銨0.3；體積 92～93 m3。培養條件：溫度27～28 ℃，空氣流速2 600～2 950 m3·h-1，培養時間350～360 h，接種量V(種子液)∶V(發酵液)=7∶92。

(3)12 m3發酵液制備罐培養基(g·L-1)：淀粉200～220，黃豆餅粉16～20，酵母粉8～10，輕質碳酸鈣1.8～2.0；消后體積 7～9 m3。培養條件：溫度27～28 ℃，空氣流速400～500 m3·h-1，發酵周期 40～60 h，種子液來源于培養100～200 h 發酵罐，接種量 1.0～1.5 m3。

1.3 測定方法

1.3.1 生物量的測定

精確量取50 mL發酵液于250 mL三角瓶中，加入適量助濾劑，置于水浴鍋中，升溫至約95 ℃，維持3～5 min；抽濾，濾餅用適量熱水洗滌后于102 ℃烘干至恒重，降至室溫稱重(W2，g)。按式(1)計算生物量(g·L-1)：

生物量=(W2-W0-W1)×20

(1)

式中：W0為濾布質量，g；W1為助濾劑質量，g；20為換算系數。

1.3.2 B1a效價的測定

精確量取2 mL發酵液于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲浸提10～20 min，用甲醇定容，過濾，進行HPLC分析。記錄峰面積，采用外標法按式(2)計算B1a 效價(μg·mL-1)：

(2)

色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃，流動相甲醇-水(體積比9∶1)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長246 nm，進樣量20 μL。

1.4 半連續發酵中補料工藝的優化

阿維菌素是阿維鏈霉菌生長繁殖到一定階段才開始合成的，其發酵培養過程經歷生長期、穩定期和產素期。在阿維菌素的工業規模化生產過程中，通常50 h時測定起步效價(200～300 μg·mL-1)，之后阿維菌素合成速率逐步加快，且效價幾乎呈線性升高[13]。發酵罐放罐時(批號記作Fn)，放出培養(300±20) h的第Fn+1批或第Fn+2批體積分數5%的發酵液，然后補入相同體積培養40～60 h的發酵液繼續培養至放罐，考察半連續發酵中補入發酵液對放罐效價和生物量的影響，并比較放罐效價與回歸效價的差異。

2 結果與討論

2.1 補入發酵液對放罐效價的影響

在阿維鏈霉菌AV-67發酵產阿維菌素的過程中，50 h 時測定起步效價，在發酵培養289 h時放出4 m3(體積分數 5%)發酵液，同時補入相同體積的培養47 h的發酵液繼續培養至放罐，效價隨培養時間的變化趨勢見圖1。

圖1 效價隨培養時間的變化趨勢Fig.1 Change trend of titer with culture time

由圖1可知，隨著培養時間的延長，效價升速很快，達到24.34 μg·mL-1·h-1；僅在補入發酵液的289 h至311 h時間段內，效價升速明顯減慢，僅為20.14 μg·mL-1·h-1。這可能與補入發酵液的稀釋作用有關。

根據補入發酵液前289 h的效價與培養時間的線性回歸曲線(圖 2)，計算351 h時回歸效價為7 464 μg·mL-1，較放罐效價(7 673 μg·mL-1)低209 μg·mL-1。后續試驗也重復了這一現象，即發酵罐放罐后補入相同體積的發酵液不會對放罐效價造成負影響。這是由于，補入發酵液中的菌絲體本身具有次級代謝能力，能立刻進行阿維菌素的生物合成；此外，補入發酵液除了減輕代謝產物的抑制、保持菌體活力外，由于其碳氮比高，為后期阿維菌素的生物合成提供了更多能量支持，有利于效價的持續快速提升。在不影響培養周期的前提下，補入發酵液增加了放罐體積、提高了放罐效價，進而提高了罐批產量。

圖2 補入發酵液前效價對培養時間的線性回歸曲線Fig.2 Linear regression curve of titer with culture time before adding fermentation broth

2.2 補入發酵液對放罐生物量的影響

阿維菌素發酵過程中，除了控制黏度、pH值等理化指標外，還應該對生物量、菌絲形態等生物指標進行控制。生物量主要與培養基配方特別是氮源含量有關[14]，也與空氣流量等有關。連續統計7批次半連續發酵罐批的放罐生物量和效價，結果見圖3。

圖3 生物量與效價的關系Fig.3 Relationship between biomass and titer

由圖3可知，7批次半連續發酵罐批的生物量在46～48 g·L-1之間，平均生物量為46.9 g·L-1，平均效價為7 491 μg·mL-1，且在此范圍內生物量與效價無明顯相關性。這可能與測定方法有關，本研究采用的測定方法不能消除死亡菌體對測定結果的影響。表明，放罐后補入培養40～60 h的發酵液，不會影響放罐生物量。

2.3 連續化驗證

某發酵車間月度8批次放罐效價和單罐產量見圖4。

圖4 試驗組和對照組效價、單罐產量的對比Fig.4 Comparison of titer and yield of single tank between test group and control group

2.4 討論

2.4.1 發酵液培養罐

研究表明，阿維鏈霉菌遺傳穩定性較差[15]，工業化生產阿維菌素通常采用二級發酵工藝。標準的設備配置為小容積的種子罐和大容積的發酵罐，原設計發酵罐與種子罐數量比為2∶1。由于阿維菌素發酵周期長達15 d，而種子罐培養周期僅2～3 d，導致種子罐出現一定程度的空置，而且隨著生產規模的擴大，種子罐的空置率更高。如果將種子罐作為發酵罐使用，由于發酵周期長、泡沫多、放罐體積小，導致產量低、生產效率不高。 為實現產能最大化，將空置的種子罐作為發酵液培養罐，用于補充半連續發酵罐批發酵液，相當于將種子罐發酵周期由350～360 h縮短至40～60 h，種子罐利用率相應提高了6～7 倍。

2.4.2 發酵液菌絲形態

與發酵罐的種子(來源于種子罐)不同，補入半連續發酵罐批發酵液的種子來源于培養100～200 h發酵罐，所以不需特別制備，來源方便。而且相關研究[12]也表明，該時期菌絲體具有菌絲生長與產物合成同時進行的混合型發酵特征，補入半連續發酵罐后，能夠立刻合成阿維菌素。培養40 h的補入發酵液菌絲鏡檢照片(圖 5a)顯示 ，菌絲體原生質飽滿、亞甲基藍染色深、菌絲長；而發酵罐后期的菌絲(圖 5b)呈現明顯的原生質匱乏、亞甲基藍染色淺、 斷菌絲多、菌體活力缺乏。表明，發酵罐放罐后補入新鮮發酵液(即更有活力的菌絲體)，有利于發酵效價的提高。

圖 5 培養40 h的補入發酵液菌絲(a)及發酵罐后期菌絲(b)的鏡檢照片(16×100)Fig.5 Microscopic images of mycelia in added fermentation broth cultured for 40 h(a) and mycelia in fermentation tank at later stage(b)(16×100)

2.4.3 循環半連續發酵工藝

阿維菌素發酵液總體表現為非牛頓流體性質。在阿維鏈霉菌發酵進程中，菌絲形態有所變化，發酵液的非牛頓流體性質逐步減弱，發酵液稀化，泡沫逐漸增多。特別是華北地區夏季空氣相對濕度大(60%～70%)，盡管完善壓縮空氣制造設備的除水設施，但受限于氣液分配定律，壓縮空氣相對濕度還是明顯高于冬季(20%～30%)。夏季發酵液液位上升更快，嚴重時發酵培養至120 h就需放出部分發酵液，以防止“逃液”。在這一過程中，可將放出的發酵液補入半連續發酵罐，放罐效價不受影響，即為循環半連續發酵工藝。同時研究發現，當發酵后期發酵液補入發酵前期罐時，放罐效價較低； 而當發酵前期發酵液補入發酵后期罐時，放罐效價卻不受影響，從側面反映了發酵后期補入更具活力的菌絲體有益于發酵效價的提高。

3 結論