稀硫酸預處理泥炭酶解發酵產乙醇研究

李麗萍，馬力通,2*，楊世波

(1.內蒙古科技大學化學與化工學院，內蒙古 包頭 014010；2.生物煤化工綜合利用內蒙古自治區工程研究中心，內蒙古 包頭 014010)

淀粉質原料[1]、糖蜜原料[2]已廣泛用于制備生物乙醇，以木質纖維素為原料的第二代生物乙醇對實現碳中和目標具有重要意義[3-4]。草本泥炭由多種草本植物殘體組成，含有豐富的纖維素、半纖維素，適合于生物乙醇的制備。張學才等[5]對酸法水解泥炭工藝及其水解液發酵制乙醇及單細胞蛋白進行了研究，發現酵母在泥炭水解液配制的培養基中繁殖力很強，且發酵濾液中含有乙醇。

目前，我國的泥炭礦床類型主要以富營養草本泥炭為主，木本泥炭為輔，蘚類泥炭次之[6]，常被用作園藝基質[7]和有機肥料[8]。路亞楠等[9]研究發現，酸預處理能使泥炭的比表面積顯著增大、孔隙率提高，適合微生物定殖；李珺等[10]研究發現，稀硫酸預處理泥炭能降解1.17%纖維素、4.44%半纖維素及9.37%木質素；黃俊等[11]研究發現，糖化發酵是木質纖維素生產燃料乙醇的關鍵步驟，對乙醇產量起決定性作用。在此，作者將草本泥炭用稀硫酸預處理后，經纖維素酶酶解、酵母發酵產乙醇，通過單因素實驗和正交實驗優化發酵工藝，擬為乙醇生產提供新途徑。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

草本泥炭，取自吉林；耐高溫釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

K2Cr2O7、乙醇、硫酸、C6H12O6，分析純，天津化學試劑三廠。

高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；UV765型紫外可見分光光度計，上海精科。

1.2 草本泥炭酶解發酵產乙醇

將草本泥炭粉碎，過100目篩；稱取草本泥炭粉末10.0 g，按固液比1∶5(g∶mL)加入5%稀硫酸于錐形瓶中，密封后置于100 ℃水浴中加熱120 min，取出冷卻至室溫；調節pH值至4.8，加入纖維素酶3.0 g，于50 ℃下磁力攪拌8 h，然后迅速置于沸水浴中使纖維素酶失活，即得酶解液；調節酶解液pH值，加入一定量的耐高溫釀酒酵母，充分攪拌后，置于一定溫度水浴中發酵一定時間，采用紫外可見分光光度計測定發酵液在600 nm處吸光度，根據乙醇標準曲線計算乙醇體積，按下式計算酒精度(100 mL溶液中乙醇的體積，%vol)。本實驗用酒精度反映草本泥炭酶解發酵產乙醇的效率。

式中：V0為根據標準曲線計算得到的乙醇體積，mL；c為乙醇標準溶液濃度，此處為0.02 g·mL-1；V為樣品溶液的體積，mL；V1為樣品溶液稀釋后的體積，mL；ρ為20 ℃時乙醇密度，此處為0.79 g·mL-1。

1.3 發酵工藝優化

1.3.1 單因素實驗

采用單因素實驗分別考察酵母加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)、發酵液pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)、發酵溫度(34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃)、發酵時間(48 h、54 h、60 h、66 h、72 h)對草本泥炭發酵產乙醇的影響。

1.3.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇酵母加量、發酵液pH值、發酵溫度、發酵時間為考察因素，以酒精度為評價指標，進行L9(34)正交實驗進一步優化草本泥炭發酵產乙醇工藝，每組實驗做3個平行。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酵母加量對草本泥炭發酵產乙醇的影響

在發酵液pH值為4.0、發酵溫度為40 ℃、發酵時間為48 h的條件下，考察酵母加量對酒精度的影響，結果如圖1所示。

圖1 酵母加量對酒精度的影響Fig.1 Effect of yeast dosage on alcoholicity

在發酵過程中，酵母可以將發酵液中的還原糖轉化為乙醇[12]。由圖1可知，隨著酵母加量的增加，酒精度先升高后降低；當酵母加量為0.05%時，酒精度為1.86%vol，此時酵母不能充分利用發酵液中的糖分，即對草本泥炭的利用率較低；當酵母加量增至0.15%時，酒精度達到最高，為2.42%vol；當酵母加量繼續增至0.25%時，酒精度降至1.99%vol，這是由于，過量的酵母會導致菌種老化[13]。因此，酵母加量以0.15%較為適宜。

2.1.2 發酵液pH值對草本泥炭發酵產乙醇的影響

在酵母加量為0.15%、發酵溫度為40 ℃、發酵時間為48 h的條件下，考察發酵液pH值對酒精度的影響，結果如圖2所示。

圖2 發酵液pH值對酒精度的影響Fig.2 Effect of pH value of fermentation broth on alcoholicity

在發酵過程中，適宜的pH值有助于酵母的繁殖[14]。由圖2可知，隨著發酵液pH值的增大，酒精度逐漸降低；當發酵液pH值為4.0時，酒精度最高，為2.87%vol；當發酵液pH值為6.0時，酒精度降至2.01%vol。表明當酸性環境逐漸減弱時，過高的發酵液pH值會使酵母活性降低，不利于乙醇的合成[15]。因此，發酵液pH值以4.0較為適宜。

2.1.3 發酵溫度對草本泥炭發酵產乙醇的影響

在酵母加量為0.15%、發酵液pH值為4.0、發酵時間為48 h的條件下，考察發酵溫度對酒精度的影響，結果如圖3所示。

圖3 發酵溫度對酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcoholicity

發酵溫度是發酵過程中最重要的影響因素，溫度過低不利于酵母的繁殖，溫度過高會導致酵母死亡[16]。由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，酒精度呈先升高后降低的趨勢，當發酵溫度為38 ℃時，酒精度達到最高，為3.14%vol；當發酵溫度升至42 ℃時，酒精度迅速降至2.64%vol。這是由于，較高的發酵溫度使酵母細胞活力下降，導致還原糖利用不完全，乙醇產量降低[17]。因此，發酵溫度控制在38 ℃較為適宜。

2.1.4 發酵時間對草本泥炭發酵產乙醇的影響

在酵母加量為0.15%、發酵液pH值為4.0、發酵溫度為38 ℃的條件下，考察發酵時間對酒精度的影響，結果如圖4所示。

圖4 發酵時間對酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcoholicity

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，酒精度先迅速升高后緩慢降低；當發酵時間為48 h時，發酵未完成，酒精度為2.97%vol；當發酵時間延長至60 h時，酒精度達到最高，為3.62%vol；繼續延長發酵時間至72 h時，酒精度降至3.39%vol。這是由于，發酵時間過長，雜菌形成優勢菌群，不利于酵母的繁殖[18]，且部分乙醇轉化為酯類物質，導致酒精度降低[19]。因此，發酵時間控制在60 h較為適宜。

2.2 正交實驗結果(表1)

表1 正交實驗結果

由表1可知，最佳工藝組合為A1B1C2D1，即酵母加量0.15%、發酵液pH值4.0、發酵溫度38 ℃、發酵時間54 h。此外，由極差分析可知，各因素對酒精度影響的大小順序為：C>D>A>B，即發酵溫度>發酵時間>酵母加量>發酵液pH值，其中發酵溫度對草本泥炭發酵產乙醇的影響最大。

2.3 最佳工藝驗證

將10.0 g草本泥炭粉末經稀硫酸預處理和纖維素酶酶解后，在酵母加量為0.15%、發酵液pH值為4.0、發酵溫度為38 ℃、發酵時間為54 h的最佳發酵工藝下進行驗證實驗，酒精度達到3.82%vol，優于正交實驗的最佳預測值3.6759%vol，說明正交實驗優化的發酵工藝可行。

3 結論

將草本泥炭用稀硫酸預處理后，經纖維素酶酶解、酵母發酵產乙醇，通過單因素實驗和正交實驗優化得到的發酵工藝為：酵母加量0.15%、發酵液pH值4.0、發酵溫度38 ℃、發酵時間54 h，在此條件下，酒精度可達到3.82%vol。