4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯芐的合成及抑制血管新生活性研究

關 麗，趙惠茹，高 璐，唐瀟瀟，李偉澤*，趙 寧，馮 鋒

(1.西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021；2.中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198)

腫瘤的生長和轉移高度依賴于血管新生，通過血管新生獲得生長所需要的營養，并通過新生血管轉移到其它組織和器官。因此，開發血管新生抑制劑成為抗腫瘤研究的主要途徑[1-4]。

近年來，斑馬魚體內化學篩選已成為研究血管新生抑制劑和鑒定先導化合物的理想方法[5-9]。斑馬魚在受精后24 h(24 hpf)左右開始發育形成血管組織，轉基因斑馬魚因為基因改造在胚胎和幼蟲發育過程中表現出增強的綠色熒光蛋白(EGFP)的血管系統特異性表達，其內皮細胞可穩定表達綠色熒光蛋白，因此，通過追蹤綠色熒光蛋白的表達，可以判斷血管組織的分布和完整性。與野生型斑馬魚相比，轉基因斑馬魚可以提供更高的血管系統分辨率，且處理過程簡單、快速，便于觀察，從而可以快速分析活胚胎對藥物[10]的反應。因此，轉基因斑馬魚可直接作為血管新生抑制劑的篩選模型。

前期研究發現，4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯芐(Aw)有明顯的抗腫瘤作用。基于此，作者以4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛為原料，以Wittig反應為關鍵步驟，通過7步反應高效合成目標化合物Aw；采用轉基因斑馬魚模型研究目標化合物Aw的抑制血管新生活性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

硅膠GF254薄層板，青島海洋化工廠；轉基因斑馬魚Tg(fli-1:EGFP)，南京大學模型動物研究中心。

柱色譜硅膠，上海譜振生物科技有限公司；DMSO，國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑均購于阿拉丁。

AVANCE-300MHz型核磁共振波譜儀，Bruker；1100 Series型ESI-MS質譜儀，美國Agilent；二氧化碳培養箱，Thermo；TR6000型全自動酶標儀，深圳雷杜。

1.2 合成方法

以4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅰ)為原料，與乙酸酐反應得到乙酰基保護產物Ⅱ，再經NaBH4還原醛基暴露出醇羥基得到化合物Ⅲ，化合物Ⅲ的羥基與二氯亞砜反應得到鹵代產物Ⅳ，然后與三苯基膦反應得到關鍵中間體膦葉立德Ⅴ[11-12]，化合物Ⅴ與2-甲氧基苯甲醛縮合得到3,5,2′-三甲氧基二苯乙烯衍生物Ⅵ，最后化合物Ⅵ通過氫化反應和脫乙酰基反應得到目標化合物Aw。合成路線如圖1所示。

圖1 目標化合物Aw的合成路線Fig.1 Synthetic route of target compound Aw

1.2.1 4-甲酰基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅱ)的合成

取4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛(3.0 g,16.5 mmol)置于茄型瓶中， 加入催化劑量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，用二氯甲烷(DCM,10 mL)溶解，緩慢滴加乙酸酐(1.60 mL,18.2 mmol)，常溫攪拌1 h；點板監測反應結束，溶液用蒸餾水萃取3次(3×10 mL)；有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，得白色晶體化合物Ⅱ3.66 g，產率99.5%。

1.2.2 4-羥甲基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅲ)的合成

取化合物Ⅱ(3.0 g,13.3 mmol)置于茄型瓶中，用10 mL乙醇溶解，冰鹽浴下緩慢加入硼氫化鈉(0.53 g,14.0 mmol)，室溫攪拌1 h后加入5%HCl調節pH值至7；減壓濃縮，殘渣用二氯甲烷萃取3次(3×10 mL)；有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，得白色固體化合物Ⅲ 2.92 g，產率96.5%。

1.2.3 4-氯甲基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅳ)的合成

取化合物Ⅲ(2.9 g,12.9 mmol)置于茄型瓶中，用二氯甲烷(10 mL)溶解，冰鹽浴下先加入三乙胺(3.7 mL,25.8 mmol)，再緩慢滴加二氯亞砜(1.8 mL,25.8 mmol)，室溫攪拌3 h；溶液用蒸餾水萃取3次(3×10 mL)；有機層用無水硫酸鈉干燥，濃縮，得亮黃色固體化合物Ⅳ 2.76 g，產率88.1%。

1.2.4 (4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯基)三苯基甲基氯化膦(Ⅴ)的合成

取化合物Ⅳ(2.5 g,10.2 mmol)和三苯基膦(2.68 g,10.2 mmol)置于100 mL茄型瓶中，用少量甲苯(5 mL)溶解，加熱回流6 h，析出大量白色粉末；冷卻至室溫，減壓抽濾，得白色粉末化合物Ⅴ 4.73 g，產率91.3%。

1.2.5 4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯芐(Aw)的合成

取化合物Ⅴ(500 mg,0.99 mmol)和2-甲氧基苯甲醛(134.6 mg,0.99 mmol)在氬氣保護下溶解于無水四氫呋喃(3 mL)中，冰鹽浴下緩慢加入氫化鈉(28.4 mg,1.18 mmol)，室溫反應過夜后濃縮；然后將反式和順式二苯乙烯的混合物在甲醇中重結晶，用15 mL乙酸乙酯溶解，加入30 mg 10%Pd/C，通氫氣下攪拌反應，反應畢過濾去除Pd/C，用少量甲醇洗滌；最后反應混合物在乙醇溶液中加入甲醇鈉以去除乙酰基，用硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯為洗脫液，體積比10∶1)純化，得黃色固體目標化合物Aw，產率42%。

1.3 抑制血管新生活性研究

采用在體轉基因斑馬魚實驗評價目標化合物Aw對轉基因斑馬魚體型及體節間血管的影響。在72 hpf，取轉基因斑馬魚正常發育胚胎，用0.5 mg·mL-1蛋白酶對胚胎進行脫卵膜處理適當時間，快速洗去蛋白酶，并用吸管反復輕柔地吹打胚胎，以幫助卵膜脫除。用移液槍移取卵液于24孔板中，每孔1 mL，每孔胚胎數為15～20條，設置陰性對照組(0.1%DMSO處理)、藥物低劑量組(1 μmol·L-1)、藥物中劑量組(5 μmol·L-1)和藥物高劑量組(10 μmol·L-1)，每組設置3個復孔。加藥結束后，將24孔板置于28.5 ℃恒溫培養箱中培養一定時間，觀察轉基因斑馬魚翹尾情況，以評價目標化合物Aw的抑制血管新生活性。

2 結果與討論

2.1 中間體與目標化合物的表征

化合物Ⅱ：m.p.118～119 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:9.93(1H,s,―CHO),7.17(2H,s,H-3,H-5),3.92(6H,s,2×―OCH3),2.38(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:191.1,168.1,152.8,134.3,115.0,106.0,56.3,20.4;ESI-MS,m/z:225.1 [M+H]+。

化合物Ⅲ：m.p.98～99 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:6.66(2H,s,H-3,H-5),4.69(2H,s,Ar-CH2―),3.84(6H,s,2×―OCH3),2.36(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:168.8,152.1,139.6,115.3,103.1,65.2,56.1,20.5;ESI-MS,m/z:227.1 [M+H]+。

化合物Ⅳ：m.p.75～76 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:6.85(2H,s,H-3,H-5),4.73(2H,s,Ar-CH2―),3.76(6H,s,2×―OCH3),2.24(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:168.3,152.0,139.4,115.0,103.2,60.7,56.1,20.4;ESI-MS,m/z:245.6 [M+H]+。

化合物Ⅴ：1HNMR(300 MHz,DMSO-d6),δ:7.92(3H,m,Ar-H),7.76(6H,dt,J=3.6 Hz、8.1 Hz,Ar-H),7.69(6H,m,Ar-H),6.30(2H,d,J=2.4 Hz,H-3,H-5),5.09(2H,J=15.0 Hz,Ar-CH2-),3.37(6H,s,2×-OCH3),2.21(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,DMSO-d6),δ:168.4,152.0, 151.9,135.5,134.8,134.6,130.6,130.4,126.9,126.7,118.8,117.6,108.5,108.4,56.2,29.4,28.8,20.6;ESI-MS,m/z:507.9 [M+H]+。

目標化合物Aw：1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:7.24(1H,m,H-3′),7.09(1H,m,H-4′),6.89(2H,m,H-5′,H-6′),6.40(2H,s,H-3,H-5),5.40(1H,brs,Ar-OH),3.86(9H,s,3×-OCH3),2.90～2.85(4H,m,-CH2CH2-);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:161.1,160.6,149.7,148.3,137.1,133.4,129.8,123.6,120.9,114.0,105.5,56.7,55.9,40.9,36.7;ESI-MS,m/z:311.1 [M+Na]+。

2.2 目標化合物Aw的抑制血管新生活性

以72 hpf轉基因斑馬魚為篩選模型，考察目標化合物Aw對斑馬魚血管新生的影響，結果如圖2所示。

圖2 目標化合物Aw對斑馬魚血管新生的影響Fig.2 Effect of target compound Aw on angiogenesis in zebrafish

從圖2可以看到，與陰性對照組相比，實驗組轉基因斑馬魚均發生了翹尾，且隨著目標化合物Aw劑量的增加，翹尾越來越嚴重；目標化合物Aw抑制轉基因斑馬魚體節間血管的生成呈濃度依賴性。表明，目標化合物Aw具有抑制血管新生活性。

3 結論

以4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛為原料，以Wittig反應為關鍵步驟，通過7步反應合成了4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯芐，通過1HNMR、13CNMR 、ESI-MS確證了其結構；在體轉基因斑馬魚實驗結果表明，4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯芐具有抑制血管新生活性，可以使斑馬魚發生翹尾，同時抑制體節間血管的生成。推測4-羥基-3,5,2′-三甲氧基聯芐可以通過抑制血管新生來發揮抗腫瘤作用。