趨化因子配體13在三陰性乳腺癌中的表達及臨床意義

劉銀鳳, 袁關利, 劉佳妮, 韓 猛, 呂 驥, 吳梓政

(河北省秦皇島市第一醫院, 1.乳腺外科, 2.呼吸與危重癥醫學科, 河北 秦皇島, 066000)

2020年世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的數據[1]顯示，乳腺癌已取代肺癌成為全球發病率第一的癌癥，估計2020年新發乳腺癌病例230萬，占所有癌癥新發病例的11.7%。三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2均呈陰性表達的乳腺癌，通常表現出較高的侵襲性特征，包括較早的復發和轉移[2]。由于缺少特異性的治療靶點，很長一段時間內化學療法是作為TNBC唯一的全身治療手段，但其臨床效果并不理想，轉移性TNBC患者的中位總生存期(OS)僅為12～18個月[2-3]。免疫檢查點程序性死亡受體1(PD-1)在多種腫瘤細胞表面表達增加，可幫助腫瘤細胞實現免疫逃逸，與腫瘤患者預后不良呈正相關[4]。阻斷PD-1、程序性死亡受體-配體1(PD-L1)的免疫治療已應用于TNBC的臨床治療，可部分改善患者的預后，但TNBC 仍是乳腺癌中預后最差的亞型[5]。

腫瘤微環境是腫瘤細胞與機體免疫系統相互作用的主要場景，趨化因子與趨化因子受體之間相互作用將不同的免疫細胞亞群募集到腫瘤微環境中，影響腫瘤的進展和治療[6]。趨化因子是一類由細胞分泌的信號蛋白或細胞因子超家族，根據氨基端半胱氨酸的排列方式可分為CXC、CC、CX3C和XC共4個大類，趨化因子與趨化因子受體相互作用，誘導特定細胞的定向遷移，在細胞生長、分化、活化和免疫應答中起重要作用[7]。趨化因子配體13(CXCL13)也稱B細胞趨化因子-1, 是CXC趨化因子家族成員之一，其特異性受體為CXC亞家族趨化因子受體5(CXCR5)。CXCL13和CXCR5信號通路與腫瘤細胞的生物學功能密切相關，尤其在腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的浸潤過程中起著至關重要的作用[8]。CXCR5表達于成熟的B細胞、濾泡輔助性T細胞和濾泡樹突細胞, CXCL13選擇性地與CXCR5結合并控制CXCR5陽性細胞向次級淋巴器官的遷移。因此, CXCL13和CXCR5的相互作用控制著B細胞在形成淋巴濾泡中的定位和結構組織[9]。雖然臨床應用免疫檢查點抑制劑的目標是恢復耗竭的T淋巴細胞功能，但B細胞也是決定治療效果的主要因素，推測CXCL13可能在免疫檢查點阻斷治療中發揮重要的作用。一項薈萃分析研究[10]也表明, CXCL13是晚期腫瘤患者對免疫檢查點抑制劑敏感性的預測指標。本研究應用生物信息學技術挖掘CXCL13 在TNBC中的生物學作用，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

下載癌癥基因組圖譜(TCGA)(https://cancergenome.nih.gov/)中132例病理類型為浸潤性癌的TNBC組織的轉錄組數據和患者的臨床資料，所有樣本均包含完整的高通量測序counts 數據及患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期、生存狀態和總生存時間，排除臨床分期不明和預后信息不詳的患者。

1.2 CXCL13在癌組織中的差異性表達的分析

登錄腫瘤免疫評估資源(TIMER)數據庫(https://cist rome.shinyapps.io/timer), 進入DiffExp module, Gene Symbol搜索欄輸入CXCL13, 分析CXCL13在不同腫瘤組織和對應的正常組織中的表達差異。采用 Wilcoxon test對TCGA 數據庫中132例TNBC組織與113例對應正常乳腺組織中CXCL13mRNA的表達情況進行分析。

1.3 CXCL13表達水平與TNBC患者臨床病理參數及OS的相關性分析

根據CXCL13表達量的中位數，將TCGA數據庫中132個TNBC樣本分為CXCL13高表達組66例和CXCL13低表達組66例，采用卡方檢驗分析2組年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移情況及TNM 分期的差異，采用Kaplan-Meier法分析并繪制2組OS曲線。應用Kaplan-Meier plotter數據庫挖掘CXCL13表達量對TNBC患者OS的影響，再次驗證CXCL13表達水平與TNBC患者OS的相關性。

1.4 功能富集分析(GSEA)

從GSEA網站(DOI: 10.107 3/pnas.0506580102, http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)獲得了GSEA軟件(version 3.0), 根據CXCL13的表達水平將TNBC樣本分為高表達組和低表達組，并從Molecular Signatures Database(DOI: 10.109 3/bioinformatics/btr260, http://www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp)下載了c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt子集合，用于評估相關途徑和分子機制，基于基因表達譜和表型分組，設定最小基因集為5, 最大基因集為5 000, 1 000次重抽樣,P<0.05、FDR<0.25為差異有統計學意義。

1.5 CXCL13與TNBC中TIL浸潤情況及常見免疫檢查點表達量的相關性分析

使用TIMER數據庫，首先進入Gene module, Gene Symbol搜索欄輸入CXCL13, Cancer Types選擇BRCA-basal, 計算出CXCL13表達量對B細胞、T細胞(CD8+T細胞和CD4+T細胞)、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等細胞浸潤情況的影響。進入Correlation module, Cancer Type選擇BRCA-basal, Correlation Adjusted by選擇None, Gene Symbols(X-axis)輸入CXCL13, Gene Symbols(Y-axis)分別輸入PD-1、PD-L1和CTLA4, 分析CXCL13表達量與常見免疫檢查點PD-1、PD-L1及細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA4)表達量的相關性。

2 結 果

2.1 CXCL13在TNBC組織中的差異性表達

TIMER數據庫DiffExp module分析顯示, CXCL13在乳腺癌(BRCA)、食管癌(ESCA)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、腎透明細胞癌(KIRC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、胃癌(STAD)、子宮內膜癌(UCEC)等腫瘤組織中和皮膚黑色素瘤的轉移病灶中呈高表達，而在結腸癌(COAD)、肝細胞癌(LIHC)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、甲狀腺癌(THCA)中呈低表達，并且在各分子分型的乳腺癌中，TNBC中CXCL13表達量高于其他亞型乳腺癌。TCGA數據庫分析的結果也顯示，與對應正常乳腺組織相比, TNBC組織中CXCL13表達量升高(P<0.001)。見圖1。

A: TIMER數據庫分析結果, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; B: TCGA數據庫分析結果。

2.2 CXCL13表達量與TNBC患者臨床病理參數及預后的關系

TCGA數據庫分析結果表明, CXCL13表達量與TNBC患者年齡、腫瘤大小無相關性，但CXCL13高表達的TNBC患者淋巴結轉移比率更低，腫瘤分期為I期的患者比率更高，差異有統計學意義(P< 0.05)。見表1。Kaplan-Meier分析結果顯示, CXCL13高表達的TNBC患者的OS高于CXCL13低表達患者，差異有統計學意義(P<0.05); Kaplan-Meier plotter數據庫驗證結果顯示, CXCL13高表達的TNBC患者OS高于CXCL13低表達患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A: TCGA數據庫分析的OS結果; B: Kaplan-Meier plotter數據庫分析的OS結果。

表1 TNBC患者CXCL13表達與臨床病理資料的關系

2.3 CXCL13表達在TNBC中的生物學功能分析

GSEA結果顯示, CXCL13表達主要與B細胞受體通路、T細胞受體通路、抗原加工與提呈通路、細胞因子及其受體相互作用通路顯著相關, CXCL13高表達時上述通路相關基因顯著富集。見圖3。

A: B細胞受體通路; B: T細胞受體通路; C: 抗原加工與提呈通路; D: 細胞因子及其受體相互作用通路。

2.4 CXCL13表達與TNBC 中TIL浸潤及常見免疫檢查點表達的相關性分析

TIMER數據庫Gene module分析結果顯示, CXCL13表達水平與巨噬細胞浸潤水平無相關性(r=-0.093,P>0.05), 與腫瘤純度呈顯著負相關(r=-0.640,P<0.001), 與B細胞(r=0.643,P<0.001)、CD8+T細胞(r=0.454,P<0.001)、CD4+T細胞(r=0.454,P<0.001)、中性粒細胞(r=0.463,P<0.001)、樹突狀細胞(r=0.528,P<0.001)的浸潤水平呈顯著正相關。TIMER數據庫Correlation module分析結果顯示, CXCL13表達水平與免疫檢查點PD-1(PDCD1)(r=0.885,P<0.001)、PD-L1(CD274)(r=0.722,P<0.001)、CTLA4(r=0.847,P<0.001)的表達量呈顯著正相關。見圖4。

A: CXCL13表達與TIL浸潤的關系; B: CXCL13表達與常見免疫檢查點表達的關系。

3 討 論

TNBC是乳腺癌中預后最差的一種亞型，發病率占乳腺癌的15%～20%, 具有分化不良、侵襲性高、生存期短、復發率高等特點。目前, TNBC的臨床治療效果仍不理想，患者的預后仍未得到顯著改善[11]。TIMER數據庫DiffExp module分析顯示, CXCL13在乳腺癌中高表達，尤其在TNBC中表達最高; 對TCGA數據庫中的數據進行挖掘也提示CXCL13在 TNBC中高表達，并且CXCL13 高表達與TNBC患者OS的延長顯著相關，這提示CXCL13是TNBC預后的預測因子。

免疫治療是指通過喚醒機體的免疫系統，增強腫瘤微環境中免疫相關細胞的抗腫瘤作用，從而消滅腫瘤細胞[12]。免疫檢查點抑制劑是目前腫瘤免疫治療的主要手段，主要免疫檢查點包括PD-1、PD-L1和CTLA-4[13]。免疫治療可延長其他實體腫瘤的生存期，是治療TNBC很有前途的一種治療策略。既往研究[12]表明, PD-L1在TNBC組織中的表達水平高于非腫瘤組織，免疫調節基因的表達升高以及腫瘤微環境中TIL浸潤豐富可改善TNBC患者的預后，這些結果也提示免疫檢查點阻斷在TNBC的治療中存在巨大潛力。基于最新公布的隨機Ⅲ期臨床試驗結果[14], 在化療基礎上加用PD-1單抗治療可部分改善晚期TNBC患者的預后，《中國臨床腫瘤學會乳腺診療指南(2021版)》和《中國抗癌協會乳腺癌診療指南與規范(2021版)》均推薦PD-1抑制劑可聯合化療應用于早期TNBC的新輔助治療或晚期TNBC的解救治療，這拉開了TNBC臨床免疫治療的序幕。多種因素均可影響 PD-1單抗的藥物療效，包括腫瘤負荷、PD-L1表達水平、抗原提呈缺陷以及腫瘤微環境中TIL的富集程度、位置、活化程度、免疫效應細胞與免疫抑制細胞的比例等[15-19]。PD-1/PD-L1單抗治療并非對所有的TNBC患者有效，如何篩選免疫治療的適用人群、增強免疫治療的療效是現階段TBNC免疫治療的難點。因此，篩選出能夠準確預測免疫治療反應的分子標志物、開發更好及更有效的免疫治療靶點以及尋找能夠和已有免疫檢查點抑制劑協同發揮作用的新靶標對于TNBC的治療具有重要意義。

本研究使用GSEA軟件對CXCL13進行單基因富集分析，結果顯示CXCL13高表達可活化B細胞受體通路、T細胞受體通路、抗原加工與提呈通路、細胞因子及其受體相互作用通路，這些通路均參與TIL的分化、遷移和活化等重要的抗腫瘤免疫生物學功能，提示CXCL13在TNBC抗腫瘤免疫應答中發揮著多重效應。在TIMER數據庫中的分析發現, CXCL13的表達與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞的浸潤水平呈顯著正相關，提示CXCL13高表達不僅可以改善TNBC患者的預后，而且在TNBC腫瘤微環境中TIL的浸潤過程中發揮著重要作用。在TIMER數據庫中進一步挖掘發現, CXCL13表達水平與最常見的免疫檢查點PD-1、PD-L1和CTLA4的表達量呈顯著正相關，提示CXCL13的表達水平可能影響PD-1/PD-L1和CTL4單抗治療TNBC的效果。本研究使用生物信息學工具對CXCL13在TNBC中的作用進行了深度探索，但仍需要大量基礎及臨床實驗對本研究預測的結果進行驗證，為CXCL13作為TNBC預后預測因子提供實驗證據和理論依據。

綜上所述, CXCL13或有作為預測TNBC患者預后分子標記物的潛力，其可能通過調控腫瘤微環境中TIL的定位、浸潤和活化程度，增強抗腫瘤免疫應答，協同免疫檢查點抑制劑在TNBC的免疫治療中發揮重要作用。