血清中相關(guān)細胞因子表達水平變化對肺結(jié)核治療效果的評估

李華 許婉華 龔蘭 謝貝 楊瑜 劉志輝 吳玲孟繁榮 王楠 王琪 張言斌

1廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所（廣州 510095）；2廣州市結(jié)核病防治所二分所（廣州 510095）；3廣州市紅十字會醫(yī)院（廣州 510220）

目前，結(jié)核病仍然是非洲和東南亞等落后地區(qū)人類的十大死因之一，結(jié)核病治療效果的評估主要依賴于癥狀好轉(zhuǎn)、痰菌轉(zhuǎn)陰、病灶吸收。對于癥狀不明顯或痰菌陰性的患者，治療效果的評估主要依賴于病灶吸收。然而病灶吸收過程漫長，且不易觀察，不能做到及時指導(dǎo)臨床醫(yī)生調(diào)整治療方案。若能從機體抗結(jié)核免疫反應(yīng)的微觀層面來評估結(jié)核病情是否得到控制及好轉(zhuǎn)，或許可提高抗結(jié)核治療效果評估的靈敏度及準(zhǔn)確度。結(jié)核發(fā)病過程中的免疫反應(yīng)主要由巨噬細胞、T 細胞等免疫細胞及其表達分泌的細胞因子介導(dǎo)［1］。血清中細胞因子可由多種細胞共同產(chǎn)生，同時細胞因子對免疫細胞的免疫活性具有一定的調(diào)節(jié)作用［2］。結(jié)核病活動期間血清中多種細胞因子表達水平升高，治療后降低［3］，說明細胞因子在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用。肺結(jié)核治療過程中伴隨著結(jié)核的控制及病情好轉(zhuǎn)，患者血清中細胞因子表達水平也會出現(xiàn)相應(yīng)變化，這種變化或許可以一定程度上反應(yīng)抗癆治療的效果，然而鮮有這方面的報道。因此本研究試圖通過監(jiān)測56 位肺結(jié)核患者治療前及強化期結(jié)束后血清中細胞因子的表達水平及其變化，分析細胞因子在治療效果評估方面的潛力，進而為其在指導(dǎo)臨床醫(yī)生治療方案調(diào)整方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納排標(biāo)準(zhǔn) 選擇2021年1-4月在廣州市胸科醫(yī)院就診的臨床確診為肺結(jié)核的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往結(jié)核病史或耐藥結(jié)核病；（2）肺部其它疾病；（3）其它感染性疾?。唬?）自身免疫性疾病（如HIV，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、哮喘、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、多發(fā)性肌炎以及皮肌炎等；（5）近三個月內(nèi)服用免疫抑制劑，激素類藥物；（6）肝腎等臟器存在器質(zhì)性病變、血液病、惡性腫瘤等；（7）妊娠期或哺乳期婦女；（8）臨床資料不完整者。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 樣本收集和保存 所有受試者在治療前及強化期治療2月后，均拍肺部X 線胸片，并抽取靜脈血3 mL，置于抗凝管中，靜置1 h 后，2 000 r/min 離心20 min，分裝血清于凍存管中，-80 ℃保存。

1.3 血清中細胞因子濃度測定 血清解凍后離心取上清。流式細胞管中加入細胞因子聯(lián)合檢測試劑盒（免疫熒光法，賽基生物）中的捕獲微球混合液25 μL，標(biāo)品管中加入梯度稀釋的標(biāo)品25 μL，樣本管中加入血清25 μL。所有管中加入25 μL熒光檢測試劑，渦旋混勻，室溫避光孵育2.5 h。反應(yīng)結(jié)束加入1 mL PBS，200g離心5 min 后，棄掉上清，加入200 μL PBS。樣品按照標(biāo)準(zhǔn)品管、樣品管的順序上流式細胞儀（BD，F(xiàn)ACSAriaTMⅡ）檢測，利用試劑盒自帶軟件做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分析血清中的白細胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 P70、IL-17、腫瘤壞死因子（TNF）-α、干擾素（IFN）-γ 和IFN-α 的濃度，見圖1。

圖1 樣本收集、保存及分析流程圖Fig.1 Flow diagram of sample collection，storage and analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理 （1）分組：將病例治療2月時胸片顯示的病灶情況與治療前相比，病灶無變化或變大的患者歸為無效組，病灶吸收的患者歸為有效組。（2）Ratio 值：治療2月時血清中各細胞因子濃度與治療前濃度的比值。（3）陽性：對于單個細胞因子來說，Ratio 值大于該細胞因子的界值認(rèn)為治療無效，即為陽性。對于串聯(lián)組合：若組合內(nèi)所有細胞因子的Ratio 值均大于其界值則為陽性；否則為陰性。并聯(lián)組合：若組合內(nèi)有一個細胞因子的Ratio 值大于其界值，則為陽性；否則為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量結(jié)果用M（P25，P75）表示；組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney 秩和檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。依據(jù)受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）探索Ratio 值的界值及檢驗效能。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較 以肺結(jié)核患者治療2月后胸片好轉(zhuǎn)認(rèn)為有效，其它認(rèn)為無效。入組患者青少年和中老年的比為1.5∶1；男女性別比為2.1∶1。無效組和有效組在年齡結(jié)構(gòu)和性別分布方面均無差異，見表1。

表1 56 例肺結(jié)核患者基本資料Tab.1 Clinicopathological characteristics of 56 patients with pulmonary tuberculosis 例（%）

2.2 12 種細胞因子血清表達水平變化分析 肺結(jié)核患者治療前及治療2 個月后，12 種細胞因子血清表達水平見表2?？傮w而言肺結(jié)核患者治療兩月后血清中IL-6、IFN-γ表達水平較治療前降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.020、0.023），IL-10 表達水平較治療前升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.011）。有效組治療兩月后血清中IL-6 表達水平較治療前降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.033），但無效組治療前后IL-6 表達水平無變化。

表2 肺結(jié)核治療2月后12 種細胞因子血清表達水平變化分析Tab.2 Analysis of serum expression levels of 12 cytokines after 2 months of pulmonary tuberculosis treatment M（P25，P75）

2.3 12 種細胞因子Ratio 值在肺結(jié)核治療效果評估中的檢驗效能 12 種細胞因子Ratio 值及其檢驗效能見表3。

表3 12 種細胞因子Ratio 值對肺結(jié)核治療有效性評估的檢驗效能分析Tab.3 Analysis of the diagnostic performance of 12 cytokines Ratio for evaluating the efficacy of pulmonary tuberculosis therapeutic efficacy M（P25，P75）

2.4 細胞因子組合在肺結(jié)核治療效果評估中的檢驗效能 為了進一步提高細胞因子對肺結(jié)核治療效果評估的檢驗效能，將以上12 種細胞因子進行串聯(lián)或并聯(lián)組合，計算其檢驗效能。檢驗效能較好的組合及其檢驗效能見表4。

表4 細胞因子串聯(lián)組合對肺結(jié)核治療有效性評估的檢驗效能分析Tab.4 Analysis of the diagnostic performance of series combination of cytokines for evaluating the efficacy of pulmonary tuberculosis therapeutic efficacy

3 討論

肺結(jié)核發(fā)病過程中，血清中多種與抗結(jié)核免疫反應(yīng)相關(guān)的細胞因子濃度升高，其中包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-1β、IL-12和IL-8 等［4-10］。肺結(jié)核早期，血清中TNF-α 水平升高，其可刺激IL-18、IL-1β 等細胞因子和黏附因子的分泌，調(diào)控細胞激活和黏附，參與肉芽腫形成，從而在結(jié)核感染中起保護作用［11-12］。然而過多的TNF-α 分泌卻會導(dǎo)致組織壞死、空洞形成［13］。IL-1β 由單核巨噬細胞產(chǎn)生，可促進空洞形成，增強巨噬細胞殺菌作用。此外，研究表明，肺結(jié)核患者血清中細胞因子的表達水平與疾病嚴(yán)重程度息息相關(guān)，如有研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6 和TGF-β1 濃度與細菌負荷直接相關(guān)，而TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β1 濃度與放射學(xué)嚴(yán)重程度相關(guān)［14］。對肺結(jié)核患者血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 等細胞因子表達水平的監(jiān)測則可作為判斷治療效果的指標(biāo)，治療過程中以上細胞因子的迅速回復(fù)預(yù)示著更好的預(yù)后［15］。結(jié)核患者血清中IL-2 和IFN-γ 水平可用于區(qū)分結(jié)核的活動性［16］?？傊谓Y(jié)核患者血清細胞因子表達水平的檢測有助于了解肺結(jié)核的活動性，監(jiān)測抗結(jié)核治療的效果，判斷病情及預(yù)后［10，17-19］。

為了評估細胞因子在監(jiān)測抗結(jié)核治療效果方面的作用，本研究分析了56例肺結(jié)核患者治療前和治療2 個月后血清中部分細胞因子表達水平的變化。就總體而言，肺結(jié)核患者治療2個月后，血清中IL-6和IFN-γ的濃度均降低（IL-6中位數(shù)從4.66 pg/mL降到3.54 pg/mL，降幅達24%；IFN-γ中位數(shù)從1.97 pg/mL降到1.47 pg/mL，降幅達25%），而血清IL-10 濃度輕微升高（中位數(shù)從1.66 pg/mL 升高到1.75 pg/mL，增幅僅有5%）。IL-6 由巨噬細胞和T 淋巴細胞等分泌，高表達會引發(fā)機體高燒、不適和體重減輕等癥狀［20-22］。多篇研究均表明，結(jié)核患者血清中IL-6和IFN-γ 濃度顯著高于潛伏感染者或健康對照者，且其濃度與結(jié)核病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)治療2 個月后，肺結(jié)核患者血清中IL-6 的降低幅度較大，可能與治療過程中，患者病情的好轉(zhuǎn)有關(guān)。IL-10 是一種抗炎因子，可抑制巨噬細胞和樹突狀細胞的免疫功能，有助于控制和啟動免疫反應(yīng)［25］，過量產(chǎn)生則會導(dǎo)致感染的失控［26］。而治療結(jié)束時高水平的IL-10 可能是結(jié)核病復(fù)發(fā)的危險因素［27-28］。本研究中，肺結(jié)核患者治療2 個月后，血清IL-10 濃度輕微上升，推測治療2 個月時，大部分肺結(jié)核患者體內(nèi)還處于一種炎癥狀態(tài)，即IL-10 對抗結(jié)核治療的效應(yīng)較IL-6 慢。

為了研究細胞因子濃度的變化與治療效果之間的關(guān)系，將患者按其治療2 個月期間影像學(xué)病灶有無縮小分類后（無變化歸入無效組），發(fā)現(xiàn)有效組中，肺結(jié)核患者治療2個月后，只有IL-6血清濃度降低（IL-6 中位數(shù)從5.71 pg/mL 降到4.17 pg/mL，降幅達27%）。進一步說明IL-6 有用于抗結(jié)核治療效果監(jiān)測的潛力。

為了排除細胞因子表達水平的個體差異，計算治療2 個月時血清中各細胞因子濃度與治療前濃度的比值，即Ratio 值，并分析了其用于評估肺結(jié)核治療效果的檢驗效能。TNF、IL-17、IL-1β 的Ratio值在判斷肺結(jié)核治療無效時的敏感度為100%，但特異度較低；IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-12P70、IFN-α、IL-8 的Ratio 值在判斷肺結(jié)核治療無效時的敏感度＞80%，但特異度較低；IL-5 和IL-10 的Ratio值在判斷肺結(jié)核治療無效時的特異度＞80%，但敏感度較低。以上研究結(jié)果說明，單獨一種細胞因子在評估抗結(jié)核治療效果方面的檢驗效能較差。

本研究分析了多種細胞因子串聯(lián)或并聯(lián)組合在評估抗結(jié)核治療效果方面的檢驗效能，發(fā)現(xiàn)IFN-γ、IL-17 和IFN-α 三種細胞因子串聯(lián)組合后，在診斷肺結(jié)核治療無效時的靈敏度84.00%，特異度70.97%，準(zhǔn)確度76.79%；IL-6 和IFN-α 兩種細胞因子串聯(lián)組合后，在診斷肺結(jié)核治療無效時的靈敏度80.00%，特異度67.74%，準(zhǔn)確度73.21%?？梢娡瑫r監(jiān)測肺結(jié)核患者血清中多種細胞因子濃度變化，可一定程度上反應(yīng)抗結(jié)核治療效果。

總之，以上研究表明肺結(jié)核患者血清中多種細胞因子濃度變化在監(jiān)測抗結(jié)核治療效果方面具有一定的潛力，但是本研究只表征了肺結(jié)核治療2月后的細胞因子濃度變化趨勢。因此，未來該方向的研究重點應(yīng)放在抗結(jié)核治療更早期血清中相關(guān)細胞因子濃度變化與治療效果關(guān)系的探尋上。