油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫脅迫下冬小麥 wrab17基因表達(dá)的影響

王璐瑤，劉麗杰,2，丁美云，孫玉婷，于夢(mèng)迪，張東向,2，李珊珊,2，金忠民,2

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161006)

黑龍江省地處中國(guó)高寒地區(qū)，幾乎沒有越冬作物，寒地冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號(hào)(Dn1)是中國(guó)首例能在黑龍江省高寒地區(qū)安全越冬(返青率>85%)的強(qiáng)抗寒性(可耐-30 ℃低溫)品種，可與大豆等作物進(jìn)行套種，不僅可解決作物重茬問題，使產(chǎn)量增加，還可改變黑龍江省長(zhǎng)期以來1年1熟的種植制度，實(shí)現(xiàn)2年3熟制，提高土地利用率和糧食生產(chǎn)率，有利于黑龍江省種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

基因?qū)儆诘?組LEA(LEA3)基因家族，參與冬小麥抗寒調(diào)控。編碼的蛋白包含166個(gè)氨基酸，其中有9個(gè)氨基酸突變率較高，與赤霉素誘導(dǎo)的蛋白ES2A有84%的同源性，可響應(yīng)低溫、脫落酸和赤霉酸的誘導(dǎo)，在小麥所有器官中均有表達(dá)。基因編碼的蛋白具有高度親水性，可在干旱和低溫脅迫下保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕干旱和低溫脅迫造成的傷害。前人研究表明，大豆、水稻、棉花、葡萄、大麥和小麥中存在不同的基因家族成員。

油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)是一種具有高活性的無毒的類固醇激素，可控制細(xì)胞分裂、植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)、種子萌發(fā)等生理過程，廣泛參與植物的逆境響應(yīng)過程。BR在植物體內(nèi)含量極低，但其生理活性卻極高，極低濃度的BR就可以對(duì)植物產(chǎn)生明顯的影響。研究表明，BR在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中起正向調(diào)控作用，外源噴施一定濃度的BR可增強(qiáng)植物對(duì)冷凍脅迫和鹽脅迫的耐受性。但目前有關(guān)BR對(duì)冬小麥抗寒基因表達(dá)的影響還未見報(bào)道。因此，本研究對(duì)Dn1中的基因進(jìn)行克隆，利用生物信息學(xué)對(duì)wrab17蛋白進(jìn)行分析，并通過qRT-PCR技術(shù)分析BR處理對(duì)低溫脅迫下Dn1中基因表達(dá)量的影響，探究基因調(diào)控Dn1的抗寒機(jī)制，以期為探索冬小麥在高寒地區(qū)安全越冬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為寒地冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號(hào)(Dn1)，由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院植物代謝生理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 材料處理

選擇大小一致、飽滿的小麥種子，于2020年9月播種于齊齊哈爾大學(xué)試驗(yàn)田，株距5 cm，行長(zhǎng)1 m，行距20 cm，正常田間管理。于小麥三葉期在葉片上噴施BR(0.1 mg·L)，對(duì)照組噴施蒸餾水，連續(xù)10 d日最低溫度平均值為5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃時(shí)，對(duì)冬小麥分蘗節(jié)和葉片進(jìn)行取樣，用雙蒸水進(jìn)行清洗，擦干分裝，液氮速凍后置于-80 ℃保存。

1.3 RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

利用Trizol法分別提取小麥葉片和分蘗節(jié)的總RNA。利用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢驗(yàn)RNA的完整性，RNA合格后置于-80 ℃保存。以葉片和分蘗節(jié)的總RNA為模板，使用PrimeScriptRT reagent Kit(TaKaRa，大連)合成cDNA第一鏈，置于-20 ℃凍存。

1.4 目的基因的克隆

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得小麥基因的全長(zhǎng)序列(Genebank登錄號(hào)：AF255053.1)。利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物wrab17-F/R(表1)，以小麥分蘗節(jié)cDNA為模板，利用Premix Taq(RR003A)(TaKaRa，大連)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序均按照說明書進(jìn)行，退火溫度為60 ℃。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，利用膠回收試劑盒(景新，杭州)進(jìn)行凝膠回收，利用DNA連接酶將目的基因連接到pMD18-T載體(TaKaRa，大連)上，并將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，利用菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性單克隆，利用質(zhì)粒提取試劑盒(索萊寶，北京)提取質(zhì)粒，然后送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究用到的引物信息

1.5 wrab17蛋白的生物信息學(xué)分析

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的基本理化性質(zhì)。利用Expasy-protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白的親疏水性。利用TMPred(https://www.expasy.org/resources/tmpred)預(yù)測(cè)蛋白的跨膜區(qū)域。利用SingleP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建小麥與其他10種植物的 wrab17蛋白進(jìn)化樹，利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對(duì)這些物種的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。

1.6 wrab17基因的表達(dá)量分析

根據(jù)基因的cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物wrab17-2F/2R，以為內(nèi)參基因，按照TB Green Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa，大連)說明書反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，3次生物學(xué)重復(fù)，用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 wrab17基因的克隆結(jié)果及其序列分析

以Dn1 cDNA為模板，利用特異性引物wrab17-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從圖1可以看出，可擴(kuò)增出500 bp左右的條帶(圖1)。經(jīng)NCBI分析表明，冬小麥基因的全長(zhǎng)為735 bp，其中開放閱讀框?yàn)?00 bp，可編碼166個(gè)氨基酸。

M：DL2000；1～4：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 wrab17蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 wrab17蛋白的基本理化性質(zhì)分析

ProtParam分析表明，wrab17蛋白的分子式為CHNOS，相對(duì)分子質(zhì)量為 17 160.71 Da，屬于穩(wěn)定蛋白，穩(wěn)定指數(shù)為 22.59，理論等電點(diǎn)(pI)為4.85。wrab17蛋白的氨基酸組成中，丙氨酸的含量最高，占比 17.5%；表面帶負(fù)電荷的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)殘基有28個(gè)，表面帶正電荷的氨基酸(精氨酸+賴氨酸)殘基有20個(gè)，平均親水系數(shù)為-0.807。

2.2.2 wrab17蛋白的親疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽以及二三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Expasy-protscale軟件分析表明，wrab17蛋白的親水性指數(shù)為0.956，疏水性指數(shù)為-2.078，為疏水性蛋白(圖2A)。TMPred在線軟件分析表明，wrab17蛋白無跨膜區(qū)(圖2B)。SingleP 5.0軟件分析表明，wrab17蛋白不存在信號(hào)肽(圖2C)。用SOPMA對(duì)wrab17蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖2D)顯示，wrab17蛋白含有72.29%的α-螺旋，5.42%的延伸鏈，3.61%的β-轉(zhuǎn)角和18.67%的無規(guī)則卷曲。進(jìn)一步利用Swiss-model對(duì) wrab17蛋白的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖2E)顯示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)相似。

A：wrab17蛋白的親水性分析；B：wrab17蛋白的跨膜區(qū)檢測(cè)；C：wrab17蛋白的信號(hào)肽分析；D：wrab17蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；E：wrab17蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.2.3 wrab17蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及同源蛋白序列比對(duì)

利用MEGA 5.0構(gòu)建小麥與二粒小麥()、硬粒小麥(subsp.Durum)、旱麥草()、冰草()、貴州懸竹()、柳枝稷()、粗山羊草()、高粱()、二穗短柄草()、蒙古冰草()wrab17蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，利用Clustal軟件對(duì)上述植物wrab17蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(圖4)。結(jié)果均表明，小麥與粗山羊草的wrab17蛋白親緣關(guān)系最近；二粒小麥與硬粒小麥以及高粱、二穗短柄草與蒙古冰草的親緣關(guān)系較近，而與小麥wrab17蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 小麥與其他10種植物wrab17蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 小麥與其他10種植物wrab17蛋白氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果

2.3 低溫脅迫對(duì)Dn1葉片和分蘗節(jié)中 wrab17基因表達(dá)模式的影響

從表2可以看出，隨著溫度的降低，Dn1葉片中基因的表達(dá)量在對(duì)照組和BR處理組均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，均在-10 ℃達(dá)到峰值，且兩個(gè)處理之間無顯著差異；Dn1分蘗節(jié)中基因的表達(dá)量在對(duì)照組和BR處理組均呈現(xiàn)“升-降-升”的變化趨勢(shì)，分別在0 ℃和-25 ℃達(dá)到峰值，均顯著高于5 ℃和-10 ℃的表達(dá)量。與對(duì)照組相比，BR處理提高了Dn1葉片中基因在5 ℃、0 ℃、-10 ℃的表達(dá)量，且在0 ℃時(shí)達(dá)到顯著水平；提高了Dn1分蘗節(jié)中基因在5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃的表達(dá)量，且在0 ℃、-10 ℃、-25 ℃達(dá)到顯著水平。

表2 BR對(duì)低溫脅迫下Dn1葉片和分蘗節(jié)中 wrab17基因相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

基因?qū)儆诨蚣易宄蓡T，在低溫和干旱脅迫中發(fā)揮著重要作用，可保護(hù)生物大分子免受逆境的傷害。LEA蛋白最初是由Dure等在棉花中被發(fā)現(xiàn)，隨后其在蕨類、藻類、苔蘚類、小麥、玉米、水稻、油菜等植物中也被鑒定出來。研究表明，LEA3蛋白與植物的抗逆性有關(guān)。

本研究表明，基因在Dn1葉片和分蘗節(jié)中均有表達(dá)，但在不同溫度下，Dn1葉片和分蘗節(jié)中基因的表達(dá)量有所不同。總體表現(xiàn)為葉片中基因在-10 ℃時(shí)表達(dá)量最高；分蘗節(jié)中基因在-25 ℃時(shí)表達(dá)量最高，且明顯高于葉片中的表達(dá)量，說明在-25 ℃低溫脅迫下，分蘗節(jié)更具有抗寒能力。這與于 晶等報(bào)道的分蘗節(jié)是決定高寒地區(qū)小麥安全過冬的重要器官相一致，也說明了基因與Dn1的抗寒性密切相關(guān)。

BR參與植物的低溫脅迫，保護(hù)植物免受低溫脅迫的傷害。前人研究表明，BR可改善低溫脅迫下黃瓜和番茄的光合作用，從而增強(qiáng)黃瓜和番茄對(duì)低溫的抗性。本研究結(jié)果表明，BR處理后可提高低溫脅迫下Dn1葉片和分蘗節(jié)中基因的表達(dá)量，在5 ℃時(shí)Dn1葉片和分蘗節(jié)中基因的表達(dá)量在BR處理組和對(duì)照組之間差異均并不顯著，而在0 ℃時(shí)差異均顯著，初步預(yù)測(cè)Dn1中基因是在0 ℃開始對(duì)寒冷做出應(yīng)答反應(yīng)。而在-25 ℃時(shí)葉片中基因的表達(dá)量較低，而分蘗節(jié)中的表達(dá)量較高，這可能與葉片本身的抗寒能力有關(guān)，進(jìn)一步證明了分蘗節(jié)具有更強(qiáng)的抗寒能力。BR處理組Dn1中基因的表達(dá)量高于對(duì)照組，也說明BR可提高Dn1的抗寒能力，對(duì)Dn1的安全越冬具有一定的促進(jìn)作用。

總之，本研究從Dn1中克隆了基因，其編碼的蛋白屬于穩(wěn)定蛋白，該蛋白無跨膜區(qū)和信號(hào)肽。-25 ℃時(shí)Dn1分蘗節(jié)中基因的表達(dá)量明顯高于葉片中的表達(dá)量。BR處理正向調(diào)控基因的表達(dá)。本研究初步探究了基因在Dn1抗寒中發(fā)揮的功能，為BR參與低溫調(diào)控提供了信息支持，也為小麥抗寒分子育種及栽培調(diào)控提供新思路，并豐富了耐寒基因資源。