冬小麥lncRNA1808調控PPP限速酶(Ta6PGDH)抗寒應答研究

李沅珊，彭瞰看，田 宇，任治鵬，蒼 晶，徐慶華，王軍虹

(東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway，PPP)是植物中糖代謝的重要途徑之一，其主要生理功能是產生還原性NADPH以及生成磷酸戊糖參與核酸代謝，該途徑的中間產物參與脂肪酸和氨基酸等合成，其中6磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH，EC1.1.1.49)和6磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH，EC1.1.1.44)為PPP限速酶。目前，已經分離了一些植物胞質或質體G6PDH、6PGDH的cDNA克隆，為分子水平解析PPP及G6PDH和6PGDH提供了研究材料。研究表明，PPP與植物的生長發育和應答多種環境脅迫有關。“寒富”蘋果腋花芽處于-30 ℃以下低溫時，呼吸代謝中PPP所占比例增多(即PPP活性增強)，而頂花芽在-25 ℃以下低溫時，PPP活性逐漸減弱；隨低溫處理時間延長，東方百合鱗片PPP被激活，G6PDH活性先減弱后增強。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，根據其在基因組上的位置分為三類：內含子長鏈非編碼RNA(intronic long noncoding RNA)、天然反向轉錄本(natural antisense transcript, NAT)和基因間長鏈非編碼RNA(long intergenetic noncoding RNA,lincRNA)。由于lncRNA不具有明顯編碼序列(coding sequence,CDS)，所以沒有編碼蛋白質的能力。目前已經在玉米、胡楊和小麥中鑒定出許多lncRNAs。研究表明，lncRNAs作為功能調控元件是真核生物基因表達調控的重要調控元件，并參與逆境響應過程。例如；甘藍中的lncRNA(BoNR8)在非生物脅迫和ABA誘導下，在萌發種子根伸長區的表皮組織中大量表達；水稻的lncRNA(LAIR)使多個LRK基因上調表達，其高表達可提高水稻籽粒產量；植物開花途徑中的關鍵調控基因FLC(flowering lous C)的mRNA轉錄受兩個lncRNA(COOLAIR和COLDAIR)調控。目前有關lncRNA調控PPP關鍵酶基因表達及活性的研究未見報道。

小麥是人類主要糧食作物，低溫(寒)脅迫嚴重影響小麥的生長和產量。東農冬麥1號(Dn1)是東北農業大學培育、能在黑龍江省高寒地區安全越冬的首個冬小麥品種，大田自然條件下，可耐-30 ℃低溫，返青率高達85%，是耐寒研究的珍貴材料。前期研究發現，Dn1的Ta6PGDH積極響應寒脅迫，其活性和相應基因表達水平上調。高表達Ta6PGDH的擬南芥表現出更好的耐寒性，植株存活率升高、清除ROS能力增強、細胞質和過氧化物酶體中的PPP增強。已經構建了3個Dn1抗寒應答lncRNA庫(5 ℃庫、-10 ℃庫和-25 ℃庫)，從中篩選出7 098個表達差異顯著的抗寒應答lncRNAs，參與不同的代謝途徑。但哪一條lncRNA調控Ta6PGDH還未可知。

基于以上結果，本研究應用生物信息學軟件，從Dn1抗寒應答lncRNAs庫中篩選調控PPP關鍵酶基因表達差異顯著的lncRNAs，分析篩選出的lncRNAs與靶基因的互作共表達；用real-time PCR鑒定lncRNA及其靶基因協同共表達、應答寒脅迫的表達譜，初步解析lncRNA1808在PPP中應答寒脅迫的生物學功能，闡明lncRNA1808調控PPP限速酶(Ta6PGDH)的機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

(1)東農冬麥1號(Dn1) 由東北農業大學小麥育種實驗室提供。將Dn1種植于東北農業大學試驗田(行長4 m；行距0.2 m；播種深度5 cm；每行播種50粒)，田間常規水肥管理。大田自然降溫條件下，連續10 d最低溫度達5 ℃(2018年10月15日)、0 ℃(2018年11月02日)、-10 ℃(2018年11月23日)和-25 ℃(2019年01月14日)為取樣時間點，隨機選取長勢一致的小麥苗，9:00-11:00間取樣葉片和分蘗節，蒸餾水清洗、濾紙擦干后，剪成1 cm小段，錫紙包裹、液氮速凍后-80 ℃冰箱凍存。

(2)Dn1抗寒應答lncRNAs庫 Dn1分蘗節抗寒應答lncRNAs庫(對照組：5 ℃庫；實驗組：-10 ℃庫和-25 ℃庫)，東北農業大學植物生理與分子生物學實驗室建庫。

1.2 方 法

1.2.1 調控PPP關鍵酶的表達差異顯著lncRNAs的篩選及生物信息分析

以構建的3個Dn1抗寒應答lncRNAs庫為研究對象，進行生物信息學分析及功能預測：(1)KEGG分析并篩選調控PPP關鍵酶的表達差異顯著lncRNAs；(2)Cytoscop分析篩選出的lncRNAs及PPP關鍵酶互作關系，聚焦于lncRNA1808及Ta6PGDH；(3)ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和CPC(http://cpc2.gao-lab.org/)在線軟件分析lncRNA1808序列，驗證其遺傳功能；(4)RNAfoldWebSever在線軟件(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預測lncRNA二級結構；(5)ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預測Ta6PGDH的一級結構及理化性質，ProtScale在線軟件(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)和SWISS-MODEL在線軟件(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預測Ta6PGDH的二、三級結構；(6)PlantCARE在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測lncRNA1808(TCONS-00021808)和Ta6PGDH(Traes1DLB4E0DFCC9)順式作用元件；(7)Cytoscop繪制lncRNA1808-mRNA(Ta6PGDH)協同共表達的表達譜。

1.2.2 Real-time PCR鑒定lncRNA1808和Ta6PGDH應答寒脅迫的表達譜

用Trizol(康為世紀Ultrapure RNA Kit)方法提取Dn1葉片及分蘗節總RNA；反轉錄試劑盒(VazymeR233-01)合成cDNA第一鏈。

使用SYBR試劑盒(ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix)、熒光定量PCR儀(MYCYCLER，美國 BIO-RAD)進行real-time PCR，小麥為內參基因，具體引物見表1。反應體系：2×ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA模板 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddHO 補足至20 μL)，反應程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 34 s,40個循環；4 ℃∞。采用2法計算基因相對表達量。

表1 PCR所用引物

1.2.3 同源克隆lncRNA1808序列全長

采用CTAB法提取Dn1分蘗節的基因組DNA，用RNase(康為世紀生物科技有限公司)純化DNA樣品。

用Primer Premier 6.0設計特異性引物(表1)：上游引物為lncRNA1808-F，5′端插入GGCTTAAU(PacI酶切位點)特定序列；下游引物為lncRNA1808-R，5′端插入GGTTTAAU(PacI酶切位點)特定序列；合成引物(博仕生物)。

以提取的總DNA為模板，以lncRNA1808-F/lncRNA1808-R為特異性引物，使用2×Taq Plus MasterMix(Dye)Kit(康為世紀生物科技有限公司)進行PCR擴增，回收PCR擴增的特異性片段，插入pClone007載體，轉化于大腸桿菌DH5α，獲得陽性菌株(pClone 007-lncRNA1808)經鑒定后，送生化公司測序并鑒定。

1.2.4 構建過表達lncRNA1808載體

將鑒定序列正確的pClone007-lncRNA1808質粒經USERTM酶切消化后，回收lncRNA1808特異性片段，插入經和雙酶切的pCAMBIA230035Su線性載體，連接液轉化于大腸桿菌DH5α，經鑒定后，獲得含過表達載體pCAMBIA230035sU-lncRNA1808的陽性菌株，送生化公司測序并鑒定。

1.3 數據處理

試驗所有數據均進行3次生物學重復，圖表制作由SPSS 22軟件完成，用Prism 6.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 lncRNA1808的功能預測及鑒定

2.1.1 鑒定TCONS-00021808(lncRNA1808)的編碼潛能

TCONS-00021808的序列全長495 bp，位于小麥 1D染色體444 147 161～444 147 655 bp處，命名其為lncRNA1808。用ORF finder在線軟件分析lncRNA1808序列全長發現，lncRNA1808潛在最長ORF為85個氨基酸，最短ORF為25個氨基酸(表2)。將上述預測的短ORF經NCBI Blastp在線軟件比對后未找到有效的匹配，說明潛在編碼的ORF未知或不存在；用CPC在線軟件分析lncRNA1808序列全長后得知，其編碼能力得分為0.043 954 2，是不完整性ORF，屬于非編碼類型，不具備編碼能力(圖1)。綜上，確定TCONS-00021808為lncRNA，將其命名為lncRNA1808。

A:Blastp分析結果；B:CPC分析結果。

表2 ORF finder分析lncRNA1808的ORF

2.1.2 lncRNA1808二級結構

應用RNAfold在線軟件預測lncRNA1808的最小自由能(minimum free energy，MFE)結構，lncRNA1808的最佳二級結構的MFE為-55.80 kcal·mol；富含穩定的莖環結構，且“大環”較多(圖2)。莖環結構在RNA與RBPs(RNA結合蛋白)互作中發揮重要作用。推測，lncRNA1808在調控靶基因表達的過程中，可能通過“大環”結合某些RBPs與“lncRNA-靶基因”共同形成復合物，在Dn1應答寒脅迫中發揮重要作用，具體作用機制有待進一步研究。lncRNA1808二級結構的預測，為解析其生物學功能和揭示其參與的調控機制提供重要理論 依據。

圖2 lncRNA1808最佳二級結構預測圖

2.1.3 lncRNA1808靶基因預測及鑒定

從已構建的3個lncRNAs庫(5 ℃庫、-10 ℃庫和-25 ℃庫)中共檢測到7 098個抗寒應答lncRNAs，通過KEGG分析篩選到20條lncRNAs調控PPP關鍵酶基因的表達差異顯著(表3)。通過Cytoscape軟件預測并繪制lncRNA1808-靶mRNA(Ta6PGDH)互作關系如圖3。初步確定：Ta6PGDH是lncRNA1808的靶基因。

表3 KEGG分析差異表達lncRNA1808及其靶基因(PPP關鍵酶)

粉色：lncRNA；藍色：靶基因。

2.1.4 lncRNA1808-靶基因互作對分析

鑒于lncRNA的調控模式中，存在lncRNA與鄰近基因協同表達或調控其表達的模式，應用Cytoscape軟件分析lncRNA1808及其上下游100 kb的mRNA進行blast比對。結果表明，lncRNA1808與18個靶mRNA是共表達的互作對，包括11個正相關和7個負相關。lncRNA1808和mRNA(Ta6PGDH)為自由能小于-30的互作對(identity>95%; E value<1E-5)，lncRNA1808-mRNA(Ta6PGDH)正向共表達，同時mRNA(Ta6PGDH)間接通過lncRNA9163(TCONS_00199163)和lncRNA6323(TCONS_00226323)調控其靶mRNA——焦磷酸依賴性磷酸果糖激酶(pyrophosphate dependent phosphofructokinase,PPi-PFK,EC.2.7.2.90)的正表達(圖4)。

橙色和紅色方塊:mRNA;深和淺綠色:lncRNA;藍色實線:lncRNA和mRNA正相關;藍色虛線:lncRNA和mRNA負相關。

2.1.5 Ta6PGDH和lncRAN1808順式作用元件分析及功能預測

順式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁側序列中，影響基因的表達。順式作用元件包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等，參與基因表達的調控。應用Plant CARE在線軟件自轉錄起始位點上游1.5 kb開始分析Ta6PGDH和lncRNA1808的順式作用元件，分析結果見表4和5。發現兩個目的基因共同含有的順式作用元件包括：核心啟動子元件(CAAT-box、TATA-box)、響應環境因子元件(ARE、MBS)、光響應元件(Box-4)和植物激素響應元件(ABRE、AuxRR-core)。其中，CAAT-box和TATA-box是轉錄真核基因啟動子序列中轉錄因子的結合位點，CAAT-box是參與轉錄RNA基因的轉錄因子結合位點，參與RNA轉錄水平的調控；在調節胭脂堿合酶啟動子中起重要作用；TATA-box是參與轉錄組蛋白或轉錄因子基因的轉錄因子結合位點。Ta6PGDH和lncRNA1808序列中均預測出這些元件，說明它們的表達在轉錄水平被調控。ABRE是ABA響應元件，AuxRR-core是AUX響應元件，可見Ta6PGDH和lncRNA1808的表達被ABA和AUX信號通路調控。Box-4是光響應元件，可見Ta6PGDH和lncRNA1808不但受溫度的調控也受到光的調控。Dn1的Ta6PGDH和lncRNA1808應答寒脅迫的過程是細胞內激素、光照、溫度、水分等綜合因素調控的過程，具體調控機制有待進一步探究。

表4 Ta6PGDH基因啟動子元件

表5 lncRNA1808啟動子元件

2.2 Ta6PGDH的理化性質、蛋白結構及親疏水性預測

小麥的CDS長592 bp，編碼178個氨基酸(圖5)。采用ProtParam在線網站分析其理化性質表明，Ta6PGDH蛋白半衰期30 h；脂肪族指數89.89；有18個負電荷的氨基酸殘基，包含8個天冬氨酸(Asp)和10個谷氨酸(Glu)；有28個正電荷氨基酸殘基，包含19個精氨酸(Arg)和9個賴氨酸(Lys)；不穩定指數(II)24.52，是一種穩定蛋白，穩定性相對較好；平均親水系數-0.278，為親水蛋白；等電點9.67，為堿性蛋白；相對分子質量為20 351.52 Da，氨基酸化學式是CHNOS。氨基酸組成中含量最高的是精氨酸(Arg)，占10.7%,含量最低的是組氨酸(His)，占1.1%。

圖5 Ta6PGDH的氨基酸序列

借助HNN方法分析的二級結構，結果顯示，共含有105個α-螺旋(58.99%)、11個延伸鏈(6.18%)、9個 β-轉角(5.06%)、53個無規卷曲(29.78%)，證明其二級結構為混合型(圖6)。采用SWISS-MODEL進行同源建模(PyMOL視圖)，得到的三級結構模型如圖7，其中螺旋部位代表螺旋，箭頭部位代表折疊，線型部位代表無規則卷曲，從圖7可以看出，α-螺旋、無規則卷曲為主要的結構原件，占據了很大一部分空間。ProtScale分析(圖8)表明，小麥6PGDH氨基酸殘基整體表現為親水性，與理化性質分析結果一致，因此推測其為親水性蛋白。

Ta6PGDH蛋白二級結構分析。藍線為α-螺旋，紅線為延伸鏈，綠線為 β-轉角，粉線為無規卷曲。

圖7 Ta6PGDH的三級結構

分數的正、負分別代表疏、親水性。

2.3 lncRNA1808-mRNA(Ta6PGDH)表達譜

由圖9可見，在分蘗節中，隨著溫度降低，lncRNA1808的表達量呈先降低后升高的變化規律，0 ℃時相對表達量最低，而后顯著升高，-25 ℃時達到峰值。lncRNA1808的靶基因的相對表達量也隨溫度降低而呈先降低后升高的變化規律，-10 ℃時相對表達量最低，-25 ℃時達到峰值。說明lncRNA1808對靶基因為正向調控。

圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖10同。

由圖10可見，在葉片中，從整體上看lncRNA1808的相對表達量隨著溫度的降低呈持續降低的趨勢，-25 ℃時降到最低，但各溫度間差異不顯著。靶基因的表達量在0 ℃時達到峰值，隨后顯著下降，-25 ℃時表達量趨近于0。推測PPP中lncRNA1808正向調控靶基因主要在分蘗節中發揮抗寒作用。

圖10 Dn1葉片中lncRNA1808和 Ta6PGDH不同溫度下的相對表達量

2.4 lncRNA1808全長克隆及過表達載體構建

用lncRNA1808-F/lncRNA1808-R(表1)進行PCR，擴增lncRNA1808，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約495 bp的特異性條帶(圖11)，與預期目的條帶大小一致。目的條帶回收后進行載體連接(圖12)，轉入大腸桿菌DH5α，陽性菌株(pClone 007-lncRNA1808)，送測序(睿博興科)并與小麥數據庫中基因序列比對后，確定獲得lncRNA1808全長(圖13)。

M:2 000 bp DNA marker; 1:PCR擴增產物。

圖12 lncRNA1808重組質粒示意圖

圖13 特異性片段序列與小麥基因組比對

3 討 論

近些年，糖代謝途徑在植物低溫脅迫中的反應備受關注。相關研究表明，植物的生長發育和各種非生物脅迫都與PPP有緊密的聯系，在寒脅迫下植物中的可溶性糖含量發生變化，其糖代謝相關酶的活性同時受到影響；植物幼苗受低溫馴化時PPP效率提高，能增強植物的抗性。目前，對于PPP功能的研究主要是圍繞6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphate dehydrogenase，6PGDH,EC1.1.1.44)、6-磷酸葡萄糖內酯酶(6-phosphogluconolactonase，PGL,EC:3.1.1.31)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH/G6PD,EC:1.1.1.49)等有關酶展開。

從PPP代謝途徑相關的酶入手，通過KEGG分析篩選出能夠調控PPP關鍵酶基因表達的lncRNA，經多種網絡途徑比對，篩選出共同作用的酶有：果糖-二磷酸醛縮酶、6-磷酸果糖激酶(PFK)、葡萄糖-6磷酸異構酶(G6PI)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6PGDH)。6PGDH是PPP的與第二個脫氫酶，因為它在大多數生物中是單向的，被認為是氧化戊糖磷酸途徑中的關鍵步驟之一。近幾年已分別從水稻、擬南芥、金針菇等生物中克隆到該基因并進行了功能研究。例如：在鹽脅迫下，水稻中的6PGDH在芽中上調，其有可能在鹽脅迫中起重要作用；6PGDH在蘋果果肉中表達量較高，且有助于愈傷組織的生長。本研究結果表明，對Dn1分蘗節抗寒有著重要作用，5 ℃、0 ℃和-10 ℃時，其分蘗節中的表達量逐漸降低；-25 ℃時，相對表達量急速升高，推測會使PPP增強，為植物生物合成提供原料和專一性供體，確保ATP的生成和利用。其代謝終產物6-磷酸葡萄糖的積累也會增強細胞滲透壓，并增強細胞抵御寒脅迫的傷害。

lncRNA在植物生長和脅迫響應中起關鍵的調控作用，如花椒的干旱脅迫、大麥的低氮脅迫和木薯的低溫脅迫。相關研究表明，lncRNA響應干旱脅迫，參與線粒體和葉綠體膜穩定性的調節，有助于維持光合作用和呼吸的正常運行。本研究從Dn1寒脅迫相關的lncRNA1808入手，以PPP為背景，通過生物信息學分析確定lncRNA1808的ORF具有不完整性，不具備編碼能力，屬于非編碼RNA。共表達分析發現，經blast比對與RNAplex計算，確定結合自由能小于-30的lncRNA1808和lncRNA9332是PPP的正向調控因子，而lncRNA1808對調控限速酶Ta6PGDH發揮著至關重要的作用。當Dn1受到低溫脅迫時，葉片中的lncRNA1808的相對表達量在各溫度間差異不顯著，且與不存在正向調控關系，說明調控模式關系有組織差異性，推測其與啟動子順式作用元件中包含分生組織表達的CAT-box元件有關。分蘗節中的lncRNA1808因響應低溫環境表達量呈先降后升趨勢，它的升高增加了靶基因的表達量，同時增強PPP代謝途徑，從而為Dn1提供能量及代謝產物，增強其抗寒性。

綜上，低溫下Dn1的lncRNA1808可能正向調控其靶基因，進而介導PPP代謝途徑響應低溫脅迫。目前lncRNA1808介導Dn1抗寒的分子機制尚不清楚，但本研究成功克隆lncRNA1808并構建過表達載體，隨后將進一步通過分析轉基因株系在低溫脅迫下的抗寒表型以及低溫脅迫前后各項生理指標的變化初步確定了lncRNA1808的生物學功能，為從分子水平深入解析lncRNA調控冬小麥的抗寒應答機制提供研究材料和思路。