諾如病毒和輪狀病毒三重熒光定量PCR檢測方法的建立

安 微 ， 鄭 晶 ， 車穎欣 ， 陳世界 ， 張 婧 ， 楊 苗 ， 謝 禮 ， 林 華

(1.成都海關(guān)技術(shù)中心 ， 四川 成都 610041 ； 2. 食品安全檢測四川省重點實驗室 ， 四川 成都 610041)

由病毒污染食物所引起的食源性病毒疾病成為目前愈發(fā)受到關(guān)注的問題。據(jù)有關(guān)報道顯示，在世界范圍內(nèi)，有超過50%的食源性病毒疾病在臨床上表現(xiàn)為非細菌性急性胃腸炎癥狀。非細菌性急性胃腸炎可以由多種病原體引起，已經(jīng)證實的病原體有諾如病毒(Norovirus，NV)、輪狀病毒(Rotavirus，RV)、星狀病毒(Astrovirus，AstV)、札如病毒(Sapovirus，SaV)和腸道腺病毒(Adenovirus，AdV)[1]。其中，大于90%的非細菌性急性胃腸炎是由NV和RV所造成的[2]。近年來，我國因NV引起的非細菌性胃腸炎的報道呈現(xiàn)逐年增多的趨勢，國內(nèi)開展的流行病學(xué)研究顯示，在我國成人感染NV的比例高達90%，可謂形勢不容樂觀[3]。RV是引起5歲以下嬰幼兒非細菌性胃腸炎的最常見的病原體，盡管目前針對RV已經(jīng)有了相應(yīng)的疫苗，但是每年在全世界范圍內(nèi)仍然有超過數(shù)百萬人因為食用被RV污染的食物和水而導(dǎo)致住院，死亡病例達到20萬之多[4]。

隨著NV和RV引起的食品污染問題越來越嚴重，加強檢測是預(yù)防疾病的一種有效方法。目前，針對NV和RV的檢測多以單一熒光定量PCR為主，三重熒光定量PCR同時檢測這3種病毒的報道較少。因此，本試驗開展了三重熒光定量PCR同時檢測GⅠ型諾如病毒(Genogroup I Norovirus,GI-NV)、GII型諾如病毒(Genogroup II Norovirus,GII-NV)和A群輪狀病毒(Group A Rotaviruses,A-RV)的方法學(xué)研究，旨在建立同時、快速、準確檢測這3種流行性較廣的病原體，給檢測和預(yù)防NV和RV提供更多的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 陽性模板與毒株 根據(jù)GI-NV、GII-NV的開放閱讀框1(Open reading frame 1,Orf1)和開放閱讀框2(Open reading frame 2,Orf2)之間的保守基因序列、A-RV的非結(jié)構(gòu)蛋白3(Non-structural protein 3,Nsp3)的保守基因序列作為檢測擴增的靶標。人工合成GI-NVOrf1和Orf2基因之間的序列，片段大小為290 bp (GenBank登錄號：M87661；合成區(qū)間：5 191～5 480 bp)；人工合成GII-NVOrf1和Orf2基因之間的序列，片段大小為280 bp (GenBank登錄號：X86557；合成區(qū)間：4 921～5 200 bp)；人工合成A-RVNsp3基因序列，片段大小為270 bp(GenBank登錄號：EU868888；合成區(qū)間：4 921～5 190 bp)。人工合成的基因片段連接到PMV質(zhì)粒上，構(gòu)建陽性質(zhì)粒。基因由北京六合華大基因科技有限公司合成。用于特異性試驗檢測的AstV、腸道AdV、SaV等引起非細菌性胃腸炎的常見病原體的陽性質(zhì)粒標準品為本實驗室保存。

動物源食品樣本包括牛肉36份、豬肉18份、雞肉20份、海鮮35份(其中蝦15份、牡蠣20份)，共計109份，為2019年5—12月送檢的動物源食品樣本，樣本按照常規(guī)方法處理后分裝編號，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 普通PCR試劑盒、DNA片段膠回收試劑盒、熒光定量試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，均購自上海近岸科技有限公司；GI-NV、GII-NV和A-RV核酸檢測試劑盒，均購自江蘇碩世生物科技股份有限公司；RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 引物與探針的設(shè)計 Kageyama等[5]針對GI-NV、GII-NV的Orf1-Orf2連接處的高度保守序列設(shè)計引物和探針，以及Jothikumar等[6]針對A-RVNsp3基因高度保守序列設(shè)計引物和探針，是目前檢測NV和RV的最理想引物探針。因此，本試驗參照參考文獻[5-6]建立三重熒光定量PCR方法，引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物和探針序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences of fluorescent quantitative PCR

1.4 質(zhì)粒標準品的制備 以人工合成的含有GI-NV、GII-NV、A-RV目的基因片段的質(zhì)粒核酸為模板，使用PMV質(zhì)粒載體的通用測序引物M13F(5′-TGTAAAACGACGGCCAG-3′)和M13R(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)進行擴增，擴增長度分別為392 bp(GI-NV)、384 bp(GII-NV)和373 bp(A-RV)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說明書。將擴增產(chǎn)物連接克隆載體，制備成重組質(zhì)粒，然后進行測序。測序結(jié)果在NCBI上進行比對，將測序結(jié)果正確的陽性重組質(zhì)粒作為GI-NV、GII-NV、A-RV的標準品。增菌培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的陽性菌株，運用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，NanoDrop 2000超微量分光光度計測定重組質(zhì)粒濃度，按照公式計算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)：重組質(zhì)粒拷貝數(shù)(copies/μL)=(質(zhì)粒濃度×10-9×6.02×1023)/(660道爾頓/堿基×堿基數(shù))。用無菌水將質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 三重熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 用質(zhì)粒標準品作為模板，進行熒光定量PCR擴增。參照熒光定量試劑盒說明書所提供的反應(yīng)條件，優(yōu)化引物濃度、探針濃度和退火溫度。所有三重熒光定量PCR優(yōu)化反應(yīng)均采用GI-NV、GII-NV、A-RV相同濃度的質(zhì)粒標準品，約108copies/μL。

1.6 三重熒光定量PCR標準曲線的建立 按照已經(jīng)優(yōu)化好的三重熒光定量PCR反應(yīng)條件，將3個重組質(zhì)粒標準品(濃度為1×1010copies/μL)等體積、等濃度均勻混合，然后再用稀釋液依次進行10倍梯度稀釋直至1×100copies/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?個10倍梯度稀釋濃度(1×108～1×102copies/μL)的新混合標準品質(zhì)粒作為模板，進行三重熒光定量PCR擴增，建立標準曲線，計算相關(guān)系數(shù)。

1.7 三重熒光定量PCR特異性試驗 采用優(yōu)化好的三重熒光定量PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，以GI-NV、GII-NV、A-RV、AstV、AdV、SaV的核酸為混合模板進行多重熒光定量PCR擴增，以檢驗反應(yīng)體系的特異性。

1.8 三重熒光定量PCR靈敏性試驗 將3個重組質(zhì)粒標準品(濃度為1×1010copies/μL)等體積、等濃度均勻混合，用稀釋液將重組質(zhì)粒標準品混合物稀釋成1×108～1×100copies/μL，作為模板，同時設(shè)陰性對照，進行多重熒光定量PCR擴增反應(yīng)，用來確定該方法的靈敏性。

1.9 三重熒光定量PCR重復(fù)性試驗 選擇106、105copies/μL和104copies/μL 3個濃度的重組質(zhì)粒標準品進行檢測，每個濃度重復(fù)5次。組內(nèi)重復(fù)性試驗：取3個濃度的重組質(zhì)粒標準品，每個濃度重復(fù)5次，計算變異系數(shù)CV(%)；組間重復(fù)性試驗：取3個濃度的重組質(zhì)粒標準品，每個濃度重復(fù)5次，在相同條件下每隔7 d進行1次檢測，共檢測5次，計算變異系數(shù)CV(%)。

1.10 動物源食品樣品的檢測 運用本試驗建立的三重熒光定量PCR方法對109份動物源食品樣品進行檢測，同時采用商品化的GI-NV、GII-NV和A-RV核酸檢測試劑盒進行對比檢測。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標準品的制備 以人工合成的陽性質(zhì)粒核酸為模板，使用通用測序引物M13F和M13R進行擴增，PCR結(jié)果如圖1所示。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，合成的基因與NCBI上的完全一致，沒有出現(xiàn)突變，可以作為質(zhì)粒標準品。測定重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)：GI-NV為3.81×1010copies/μL，GII-NV為2.74×1010copies/μL，A-RV為3.35×1010copies/μL。將制備的3種重組質(zhì)粒用稀釋液稀釋成1×1010copies/μL，作為質(zhì)粒標準品-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r用無菌水將質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋，稀釋度為1×108～1×100copies/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmidM：DL2 000 DNA Marker；N：陰性對照(Negative control)；1：GI-NV(392 bp)；2：GII-NV(384 bp)；3：A-RV(373 bp)

2.2 三重熒光定量PCR反應(yīng)條件 經(jīng)過對三重熒光定量PCR反應(yīng)條件的多次試驗，最后確定三重熒光定量PCR檢測GI-NV、GII-NV、A-RV的最佳反應(yīng)體系：2×NovoStart?Probe qPCR SuperMix 25 μL，GI-F 0.5 μL，GII-F 0.5 μL，Nsp3-F 0.5 μL，GI-R 0.5 μL，GII-R 0.5 μL，Nsp3-R 0.5 μL，GI-P 1.2 μL，GII-P 1.2 μL，Nsp3-P 1.2 μL，GI-NV模板2 μL，GII-NV模板2 μL，A-RV模板 2 μL，RNase Free Water 12.4 μL，共計50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min(收集熒光)，共40個循環(huán)。

2.3 三重熒光定量PCR標準曲線 利用優(yōu)化好的三重熒光定量PCR反應(yīng)條件，將3個重組質(zhì)粒標準品用稀釋液進行10倍梯度稀釋(1×108～1×102copies/μL)作為模板，進行三重熒光定量PCR的標準曲線繪制，結(jié)果顯示，GI-NV、GII-NV和A-RV在3個對應(yīng)的熒光通道都有較好的線性關(guān)系。其中，GI-NV的相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1，GII-NV的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7；A-RV的相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1。質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)與Ct值的線性關(guān)系見圖2。

圖2 三重熒光定量PCR標準曲線Fig.2 Standard curve of triple fluorescence quantitative PCRA：GI-NV； B：GII-NV； C：A-RV

2.4 三重熒光定量PCR特異性試驗 特異性試驗結(jié)果顯示，本試驗建立的三重熒光定量檢測方法只能特異性的檢測到GI-NV、GII-NV和A-RV，其他病毒樣本均為陰性，表明該方法具有很好的特異性，結(jié)果見圖3。

圖3 三重熒光定量PCR特異性試驗Fig.3 Specificity test of triple fluorescent quantitative PCRA：GII-NV； B：GI-NV； C：A-RV； D：陰性對照(Negative control)

2.5 三重熒光定量PCR靈敏性試驗 將GI-NV、GII-NV、A-RV三種重組質(zhì)粒標準品混合后10倍系列稀釋，作為檢測模板，經(jīng)過檢測，當設(shè)定Ct值≤35時，確定多重熒光定量PCR對GI-NV、GII-NV、A-RV最低檢出限均為1×102copies/μL，表明該方法靈敏度較高,結(jié)果見圖4。

圖4 三重熒光定量PCR靈敏性試驗Fig.4 Sensitivity test of triple fluorescent quantitative PCRA：GI-NV； B：GII-NV； C：A-RV

2.6 三重熒光定量PCR重復(fù)性試驗 三重熒光定量PCR組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗所用模板為106、105copies/μL和104copies/μL 3個濃度的重組質(zhì)粒標準品，每個試驗重復(fù)進行5次，結(jié)果見表2和表3。NV和RV的檢測結(jié)果在組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于5%，說明建立的三重熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性較好。

表2 三重熒光定量PCR重復(fù)性試驗組內(nèi)結(jié)果Table 2 Within group results of triple fluorescence quantitative PCR repeatability test

表3 三重熒光定量PCR重復(fù)性試驗組間結(jié)果Table 3 Inter group results of triple fluorescence quantitative PCR repeatability test

2.7 動物源食品樣品檢測 利用本試驗建立的GI-NV、GII-NV、A-RV三重熒光定量PCR檢測方法對收集的109份動物源食品進行檢測，同時使用商品化的試劑盒進行比對，結(jié)果顯示，2種檢測方法的符合率達到100%，結(jié)果見表4。

表4 樣品檢測結(jié)果Table 4 Sample test results

在36份牛肉、18份豬肉、20份雞肉和35份海鮮(其中蝦15份、牡蠣20份)共計109份動物源食品樣品中，共檢測出8份樣品中含有GI-NV、GII-NV、A-RV中的1種或者2種。具體結(jié)果：2份牛肉中檢出GII-NV；1份豬肉中檢出A-RV；雞肉中無檢出；1份蝦中同時檢出GI-NV和GII-NV；1份牡蠣中檢出GI-NV、1份牡蠣中檢測GII-NV、2份牡蠣中同時檢出GII-NV和A-RV。

3 討論

由諾如病毒和輪狀病毒污染食物所引起的非細菌性急性胃腸炎病越來越多，并且混合感染和繼發(fā)感染也較為普遍，給臨床診斷帶來很多困難[7-8]。熒光定量PCR檢測方法是近年來應(yīng)用較廣的新型核酸定量檢測技術(shù)，其具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強、污染少、節(jié)約時間等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測、基因表達研究、細菌和病毒檢測等方面。王毅謙等[9]建立了基于Allglo探針技術(shù)同時檢測GI-NV和GII-NV的雙重熒光定量PCR方法；周冬梅等[10]建立了基于TaqMan探針技術(shù)同時檢測GI-NV和GII-NV的雙重熒光定量PCR方法；李凡[11]、陳峰等[12]建立了RV的熒光定量PCR檢測方法。但是針對NV和RV同時檢測的熒光定量PCR方法還很少見。本試驗通過人工合成GI-NV、GII-NV、A-RV的保守序列，并通過PCR擴增、DNA片段連接克隆載體，從而構(gòu)建了含有GI-NV、GII-NV、A-RV的保守序列的重組質(zhì)粒標準品，在重組質(zhì)粒標準品的基礎(chǔ)上建立了同時檢測GI-NV、GII-NV、A-RV的多重熒光定量PCR方法。本試驗之所以采用質(zhì)粒標準品作為模板進行研究，主要有以下原因：質(zhì)粒標準品相對于病毒基因組而言長度較小，進行PCR擴增操作比較簡便快捷，同時PCR擴增過程不容易斷裂，而病毒基因組為RNA，具有容易降解的特性。在優(yōu)化多重熒光定量PCR反應(yīng)條件時，采用質(zhì)粒標準品能保證操作過程的穩(wěn)定性，同時還避免了每次試驗都要進行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄等過程帶給試驗的誤差。本試驗建立的三重熒光定量PCR檢測GI-NV、GII-NV、A-RV方法實現(xiàn)了一管三重檢測，3種病毒質(zhì)粒標準品的檢測靈敏度均為100 copies/μL，并且具有良好的特異性和重復(fù)性。本試驗建立的三重熒光定量PCR方法能夠?qū)χZ如病毒和輪狀病毒進行快速鑒別，并對諾如病毒和輪狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。