低密度脂蛋白和高密度脂蛋白亞類鑒定在乙型肝炎病毒相關性肝癌發生風險預測中的意義

羅恒 衛向紅 吳清明 向世強 張若涵

肝臟是脂類合成和代謝的主要器官，肝臟受損與脂質代謝紊亂密切相關，近年來發現由于脂質代謝紊亂導致的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發病率逐漸上升[1]。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度低脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)水平異常與HCC的發展密切相關[2]。LDL和HDL可根據不同分離技術分為多種亞型，比如：凝膠電泳方法可將LDL分為7種亞型LDL1～7，HDL可分為HDL2a、HDL2b、HDL3a、 HDL3b 和 HDL3c等多個亞型[3-4]。這些亞型與多種疾病的發生和發展獨立相關，但對LDL、HDL亞型在HCC發生中的作用研究相對較少。我們研究了LDL、HDL亞型在肝癌發生中的作用和其對乙型肝炎(hepatitis B virus，HBV)感染相關性HCC患者預后評估的價值，為進一步探索HBV相關性肝癌的發病機制和提高肝癌患者的生成預后提供新的思路。

對象和方法

一、對象

在2017年1～12月期間，前瞻性納入90例在空軍軍醫大學第一附屬醫院接受診斷和治療的肝病患者，病因學有明確的HBV感染史，且經乙肝五項定量或HBV-DNA檢測確定為乙肝病毒攜帶者。根據臨床診斷標準(4項中至少符合2項)或肝穿刺組織學檢查診斷，確診為HCC的患者納入肝癌組(n=30)，男性患者21例，女性患者9例，平均年齡(54.07±10.13)歲，出現肝硬化但證實尚未發生癌變的患者納入肝硬化組(n=30)，男性患者19例，女性患者11例，平均年齡(54.23±8.11)歲。其余患者則納入慢性肝炎組(n=30)，男性患者22例，女性患者8例，平均年齡(55.83±9.21)歲。納入標準：就診前無抗腫瘤治療史；具備完善的臨床信息，包括B型超聲、相關血清學檢查和肝活檢等。合并酒精性/非酒精性肝炎、丙型病毒、戊型病毒感染的患者被排除在外，此外肝衰竭和腎臟功能嚴重障礙的患者也應該被剔除研究。本研究的所有患者均給出了書面的知情同意書，同時本研究得到了我院倫理委員會批準。

二、方法

1.檢測指標：過夜禁食12 h以上后，平行收集2份靜脈血樣本3 ml和4 ml，離心獲得血清后，一管送往檢驗科，在2 h內通過標準酶比色法檢測總膽固醇、HDL-C，利用Friedewald公式計算LDL-C水平。另一管保存在-80 ℃，在分析前再解凍。另一管保存在-80 ℃，在分析前再解凍。使用Lipoprint系統(美國Quantimetrix公司)和聚丙烯酰胺凝膠電泳對LDL亞類進行鑒定，電泳時間60 min，電流3 mA，利用數字掃描儀和全自動計算機對電泳結果進行量化。LDL亞類分布為七個帶(LDL1～7)，與梯度凝膠電泳獲得的數據一致。大LDL：LDL1～2，小而密LDL(small dense low density lipoprotein，sdLDL)：LDL3～7。利用二維凝膠電泳和免疫印跡法對HDL亞類進行鑒定，使用標準曲線(包括牛血清白蛋白、鐵蛋白和甲狀腺球蛋白)對HDL濃度值進行校準，將每個HDL亞類的相對百分比濃度乘以樣品中的apoA-I濃度得出相對濃度apoA-I的每個HDL亞類的含量(mg/L)。

三、統計方法

使用SPSS26.0軟件進行數據分析。將計量資料進行K-S正態性檢驗和方差齊性分析，所有計量資料均符合正態分布，用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用事后LSD-t檢驗；計數資料以例(%)表示，進行χ2檢驗。采用Logistic回歸模型分析影響肝病患者發生肝癌的危險因素。受試者工作特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲線分析LDL、HDL亞類對肝癌發生的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者臨床資料比較見表1。 與慢性肝炎組比較，肝硬化組AST、LDL-C水平顯著降低，肝癌組總膽固醇顯著增加， AST、HDL-C水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與肝硬化組比較，肝癌組總膽固醇顯著增加， AST、HDL-C水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 3組臨床資料比較

2.慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者LDL和HDL亞型比較見表2。 與慢性肝炎組比較，肝硬化和肝癌患者sdLDL水平顯著上升，HDL2和HDL3水平顯著降低，。與肝硬化組比較，肝癌患者sdLDL水平顯著上升，HDL2和HDL3水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 3組LDL、HDL亞型比較(mg/L)

3.Logistic回歸模型分析影響HBV相關性肝癌發病風險的臨床因素 經Logistic模型分析，單因素分析結果顯示總膽固醇、HDL、sdLDL、HDL3都是影響慢性肝病患者發生肝癌的危險因素，將上述變量納入多因素模型，結果顯示sdLDL水平上升和HDL3水平下降是影響慢性肝病患者發生肝癌的獨立危險因素。見表3。

表3 logistic模型分析影響慢性肝病患者發生肝癌的臨床因素

4.ROC曲線 血清sdLDL、HDL3預測肝癌的AUC為0.899(0.835～0.964)、0.816(0.731～0.902)。截斷值為28.295mg/L、20.06mg/L，特異度為0.883、0.967，靈敏度為0.867、0.600。見圖1。

圖1 ROC曲線分析sdLDL、HDL3對肝癌的預測價值(A)sdLDL；(B)HDL3

討論

HCC是來自肝臟上皮細胞的惡性腫瘤，發病率和死亡率分別排到了惡性腫瘤的第6、4位，影響肝癌發生的因素很多，包括：病毒感染、酗酒、黃曲霉素暴露等[5]。近年來發現在慢性肝臟疾病中存在脂蛋白異常，肝臟脂質失調是肝臟受損的基本特征[6]。在本研究中發現，在肝受損患者中存在脂蛋白代謝異常，特別是LDL亞組sdLDL和HDL亞組HDL3，較高的sdLDL和較低的HDL3水平提示慢性HBV相關性肝病患者更容易發生肝癌。

肝臟是重要的脂質代謝器官，是產生內源性脂質和脂蛋白聚集的中心。脂質代謝異常與腫瘤形成、進展以及治療后的預后顯著相關。肝臟可以合成約75%的內源性膽固醇，LDL-C主要通過肝細胞合成，LDL-C和LDL水平反映了肝臟合成能力。當肝臟受損后，LDL-C和LDL水平開始下降[7]。LDL主要可劃分為大LDL和sdLDL，近年來發現不同亞組份的LDL對疾病的發生具有不同的作用。比如與甘油三酯、LDL等比較，在心血管疾病中sdLDL對預測冠心病等的發生更敏感，這可能與sdLDL導致更強烈的氧化應激反應，從而使內皮細胞受損壞死有關[8]。sdLDL的增加與肥胖、胰島素抵抗相關，據報道，丙型病毒感染的患者在基于干擾素的療法或任何DAA療法清除丙肝病毒治療后，可能會出現動脈粥樣硬化病變，在開始治療后的一年這部分肝炎患者血清sdLDL、LDL水平都顯著升高。同時研究還表明了sdLDL的增加與頸動脈中膜厚度密切相關[9]。這提示我們對于肝炎患者在治療后的一段時間內對sdLDL水平的監測是具有意義的。同時有研究發現，在日本男性脂肪肝的受試者中，其sdLDL顯著增加[10]。在另一項非酒精性脂肪肝炎的研究中發現，sd-LDL與超聲心動圖顯示的控制衰減參數值呈正相關，同時還與肝纖維化程度呈現正相關[11]。在肝外膽管癌中，Guo等[12]發現sd-LDL水平升高，而在膽汁淤積緩解后，sd-LDL降低。我們據此猜測，在慢性肝疾病的進展過程中，持續的sdLDL水平升高可能是加劇疾病的原因。我們發現，在HCC患者中，LDL-C的水平增加，同時sdLDL水平也顯著上升。而在風險模型分析后也證實了血清sdLDL水平是影響HBV相關性慢性肝病患者發生癌變的獨立危險因素。此外，LDL亞型還與肝臟疾病治療后的預后相關。Siddiqui等[13]發現sd-LDL對肝移植后的心血管事件發生獨立相關，sdLDL可以獨立的預測肝移植后的心血管事件發生風險。

HDL-C是膽固醇在肝臟代謝的一部分，最近的研究顯示，在肝臟腫瘤組織中HDL-C水平顯著降低。在HCC發生時，膽固醇的代謝和合成途徑都受到損傷，因此在血漿中膽固醇水平降低。而隨著肝臟受損的進展，肝臟對HDL-C的消耗逐漸增加[2]。HDL2和LDL3是HDL的亞組成分，有研究顯示在肝硬化患者中，隨著疾病的進展，穩定型肝硬化、急性代償期、肝衰竭患者中的HDL-C、HDL2-C、HDL3-C的水平依次降低，HDL-C、HDL2-C、HDL3-C可以作為肝硬化疾病進展和存活的可靠性預測因子[14]。HDL2(HDL2b、HDL2c)屬于大顆粒HDL，HDL3(HDL3a、HDL3b、HDL3c)屬于小顆粒HDL，有研究發現在正常血脂血清中使用肝癌細胞進行孵育，血清中的HDL2b降低，而HDL3a釋放增加[15]。提示我們肝癌患者中HDL亞組水平異常。Hayashi等[16]研究者證明在經過藥物治療12個月后，2型糖尿病患者血清HDL2、1bLDL-C的水平顯著上升，同時sdLDL-C水平降低。這也提示我們LDL、HDL亞型在內環境脂質異常中具有重要作用，具有反映內環境脂質穩態的潛能。我們的研究發現在肝癌患者中血清HDL3的水平降低。

總之，我們通過分析不同肝病患者血清LDL、HDL亞型，發現血清sdLDL和HDL3水平與HBV相關性肝癌的發生風險有關，這值得我們在未來進行更深入的探討。在HBV感染的慢性肝疾病患者中，對血清LDL、HDL亞型進行監測和鑒定，有助于預測疾病的進展風險，并及時進行干預。