干熱處理對杏鮑菇蛋白質功能和結構的影響

陳怡靜，李萍，康雨薇，高璐，王琨，崔桂友*，許慧卿*

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.江蘇旅游職業學院烹飪科技學院，江蘇 揚州 225500；3.江蘇康能生物工程股份有限公司，江蘇 儀征 211413）

杏鮑菇是一種藥食兩用的食用菌品種，具有獨特的莖、宜人的香氣和良好的烹飪品質。此外，杏鮑菇還含有大量的生物活性物質，如蛋白質、多糖、膳食纖維等，均具有潛在的生物活性功能。

熱處理在食品加工行業中廣泛用于促進食品的功能性質。干熱處理是熱處理的一種，是對食品進行物理改性的一種方法，它以空氣為介質，通過提高介質的溫度使物質內部溫度升高，從而使食物表面和內部達到相同溫度。在干熱加熱過程中，蛋白質在高溫、低水分條件下，通過影響蛋白質分子的化學鍵，特別是疏水鍵，引起蛋白質分子的重新排列，從而導致蛋白質結構和功能特性的變化，如蛋白質變性、蛋白質聚合物的形成、揮發性風味物質的產生等。

目前對蛋白質高溫變性的研究大多是在濕熱條件下進行的。張雪飛通過研究濕熱誘導對聚乳清蛋白的影響，發現巰基隨著溫度的變化而減少。劉芳等在研究堿與熱處理對大米蛋白質結構和功能的影響時，發現隨著溫度的升高蛋白質結構發生改變，溶解性無明顯變化，但乳化性和穩定性在90℃時均達到最大。近年來對杏鮑菇的研究多集中在杏鮑菇多糖的提取或以杏鮑菇為原料進行產品創新，對杏鮑菇蛋白質的研究相對較少，特別是以干熱作為加熱處理方式的相關研究更為少見。本文旨在研究不同干熱溫度對杏鮑菇蛋白質結構和功能的影響，從杏鮑菇蛋白質的結構、理化性質和功能特性等方面研究干熱處理對杏鮑菇蛋白質的作用機理，以拓寬干熱處理杏鮑菇蛋白質在多種食品中的應用，為其開發新型工業化成品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮杏鮑菇：市售；磷酸鹽緩沖液：上海博微生物科技有限公司；Tris-甘氨酸（Gly）緩沖液：福晨（天津）化學試劑有限公司；尿素：天津市科密歐化學試劑有限公司；5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：國藥集團化學試劑有限公司；β-巰基乙醇：慧興生化試劑有限公司；雙縮脲試劑：廣州和為醫藥科技有限公司；Ellman’s試劑：安徽酷爾生物工程有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）：西亞化學科技（山東）有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

S-4800場發射掃描電子顯微鏡：日本日立公司；J-810圓二色光譜儀：日本JASCO公司；UV-1800紫外分光光度計：上海棱光有限公司；FSH2A可調高速均質機：上海索廷智能設備股份有限公司；BDW1-FW-200高速粉碎機：北京中西華大科技有限公司；SHZ-C水浴振蕩器：北京海天友誠科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將新鮮杏鮑菇切片，45℃烘干12h。杏鮑菇經高速粉碎機粉碎后，過80目篩，置于密封容器中保存備用。

1.3.2 杏鮑菇蛋白的分離

將粒度均勻的杏鮑菇粉與去離子水按1∶15（g/mL）混合，參照柳芬芳等的方法提取杏鮑菇蛋白質。將溶液用NaOH調pH值至12，連續振蕩2.5 h后，4 000×g離心20 min。用HCl將pH值調至3.6，于4℃冰箱中靜置1h，直至出現沉淀。將溶液于中4 000×g離心10 min，取沉淀調節pH值至中性。經冷凍干燥后4℃冷藏備用。

1.3.3 杏鮑菇分離蛋白的干熱處理

將 1.3.2得到的蛋白粉在 65、80、95、110、125 ℃下干熱處理30 min，冷卻至25℃，放入真空袋中保存備用，并以未干熱處理的杏鮑菇蛋白粉（即生樣）為對照。

1.3.4 杏鮑菇蛋白質理化性質的測定

1.3.4.1 巰基的測定

參考Ellman和Benesch的方法并稍作修改，測定不同杏鮑菇蛋白質處理組的巰基（sulfhydryl group，SH）。稱取杏鮑菇分離蛋白用8 mol/mL、pH8.0的Tris-Gly尿素緩沖液配制成0.6%的蛋白溶液。搖勻后取溶液測定游離巰基和總巰基的含量。同時，將牛血清蛋白配制成 0、2、4、6、8、10 mg/mL 蛋白溶液，與雙縮脲試劑混合均勻后靜置反應10 min，用紫外分光光度計測量540 nm下的OD值，得到標準曲線方程：y=0.042 5x+0.001 5。以同樣方法測量其樣品蛋白在540 nm下的OD值，根據標準曲線計算蛋白濃度，記為C（mg/mL）。

游離巰基含量的測定：取蛋白溶液加入4%、4 mg/mL DTNB溶液，混合振蕩5 min，在412 nm波長下測吸光值記為A。

總巰基含量的測定：取蛋白溶液，加入0.2%β-巰基乙醇溶液，振蕩混勻2 h，以體積比1∶2加入12%TCA溶液，靜置1 h后，10 000×g離心10 min，棄上清液，取一定體積8 mol/mL、pH8.0的Tris-Gly尿素緩沖液溶解沉淀，再加入Ellman’s試劑，然后用紫外分光光度計在波長412 nm下測定吸光值。

式中：73.53為埃爾曼試劑的摩爾消光系數。

1.3.4.2 溶解度的測定

參考Lee等的方法測定杏鮑菇分離蛋白的溶解度。配制0.4%的蛋白溶液，恒溫振蕩10 min，離心15 min，取上清液，用考馬斯亮藍法測定離心前后樣品中的蛋白質含量。杏鮑菇分離蛋白的溶解度計算公式如下。

1.3.4.3 發泡能力和發泡穩定性的測定

參考Oboroceanu等的方法測定杏鮑菇蛋白質的發泡能力及其穩定性。取50 mL杏鮑菇蛋白溶液（1%）用勻質機在10 000 r/min、25℃下均質2 min。通過比較0 min時的泡沫體積與樣品的初始液體體積來測定發泡能力。發泡穩定性是比較10 min和20 min的泡沫體積與樣品的初始泡沫體積。計算公式如下。

式中：V為 0 min 時的泡沫體積，mL；V為 10 min和20 min時的泡沫體積，mL。

1.3.4.4 微觀結構

形態特征：采用掃描電鏡分別對各組杏鮑菇分離蛋白的形態特征進行觀察。取樣品粘貼到樣品臺上，進行噴金鍍膜處理，放入掃描電鏡抽真空，在10 kV的電壓下，調整束斑尺寸，聚集清晰后，拍攝樣品的形態結構圖像。

圓二色性光譜：采用圓二色譜法對杏鮑菇蛋白進行二級結構分析。參考Chandrapala等的試驗方法，配制濃度為0.5 mg/mL的蛋白溶液，在連續充氮的條件下測定其二級結構。

光譜分析條件：遠紫外區域為163 nm～280 nm，掃描速度為10 nm/min，光譜間隔0.1 nm，每個樣品進行3次掃描，取其平均值。

紫外光譜分析：用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）配制濃度為1 mg/mL的杏鮑菇分離蛋白溶液，在紫外分光光度計下進行掃描，掃描波長為190 nm～300 nm。

1.3.5 數據統計分析

本研究所有試驗數據采用SPSS16.0軟件進行鄧肯多重范圍檢驗（Duncan's multiple range tes，DMRT）分析，采用Origin 2018 64Bit作圖。不同小寫字母表示差異顯著（p＜0.05）。所有數據均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 巰基檢測結果

不同干熱處理溫度對杏鮑菇蛋白質巰基含量的影響見表1。

表1 不同干熱處理溫度對巰基含量的影響Table 1 Effect of different dry heat treatment temperature on the sulfhydryl group content of Pleurotus eryngei protein

由表1可知，生樣的杏鮑菇蛋白總巰基含量為84.54 μmol/g 蛋白，游離巰基含量為 21.49 μmol/g蛋白。總巰基和游離巰基的含量均隨干熱溫度的升高而降低。在125℃時，均最低，分別為39.05 μmol/g蛋白和18.01μmol/g蛋白。干熱處理組中總巰基含量和游離巰基含量均顯著低于對照組（p＜0.05）。隨著干熱處理溫度的升高，蛋白質的高級結構展開，暴露出內部巰基，加速了巰基向二硫鍵的轉變，使所測得巰基含量逐漸下降。趙謀明等觀察到雞肉蛋白中的巰基含量隨著熱處理溫度的升高而逐漸降低，與本研究結果相似。

2.2 溶解度測定結果

蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質-水相互作用影響溶解度。杏鮑菇蛋白質的溶解度分布如圖1所示。

圖1 不同干熱處理溫度對溶解度的影響Fig.1 Effect of different dry heat treatment temperatures on solubility

由圖1可知，隨著干熱處理溫度的升高，杏鮑菇蛋白質的溶解度也逐漸增加，到110℃時達到最大值（0.90±0.03）%，然后在125℃時迅速下降，顯著低于其他處理（p＜0.05），且明顯看出有少量沉淀生成。產生這種現象的原因可能是蛋白質經過干熱處理后，以聚集體的形式存在，蛋白質重新組合，導致溶解度急劇下降。這一現象與黃友如等的研究結果相似。Sun等在研究熱處理對玉米醇溶蛋白的影響中也證實了這一變化趨勢，說明這種現象的發生并不偶然。

2.3 發泡能力和發泡穩定性測定結果

不同干熱處理溫度對杏鮑菇蛋白發泡能力和發泡穩定性的影響見表2。

表2 不同干熱處理溫度對杏鮑菇蛋白發泡性能的影響Table 2 Effect of different dry heat treatment temperatures on foaming properties of Pleurotus eryngii protein

由表2可知，杏鮑菇蛋白質的發泡能力隨溫度的升高在95℃時達到最大值（83.23%），95℃之前隨著溫度的升高而升高，95℃之后逐漸下降。除125℃處理組外，其余干熱處理組的發泡能力均顯著高于生樣。干熱處理后杏鮑菇蛋白的發泡穩定性的變化趨勢與發泡能力正好相反。發泡穩定性在95℃時最低（52.86%），然后隨溫度的升高逐漸增加。干熱處理20 min后的發泡穩定性略低于處理10 min的樣品。適當熱處理使蛋白質分子解聚，分子柔韌性增加，導致吸附在界面上的蛋白質數量增加，氣泡膨脹增大，有利于氣泡的改善。但隨著干熱處理溫度的升高，蛋白質發生聚合，其溶解度降低，蛋白質不易在空氣和水界面上吸附，其發泡能力和發泡穩定性降低。夏珂在研究熱處理對蕎麥蛋白的影響時發現，干熱處理使蛋白質的起泡性出現先升高后下降的現象，但出現最大值時的溫度與本試驗不一致，產生這種差異可能由于蛋白質的來源不同。

2.4 微觀結構

2.4.1 形態特征

圖2為杏鮑菇蛋白在掃描電鏡（4.05 cm×4.80 cm）下的微觀結構。

圖2 不同干熱處理溫度對杏鮑菇蛋白質形態特征的影響Fig.2 Effect of different dry heat treatment temperature on morphological（SEM）characteristics of Pleurotus eryngii protein

由圖2可以看出，未經干熱處理的杏鮑菇蛋白質的結構和外觀光滑，沒有裂紋和孔洞。經過干熱處理后，蛋白質表面出現了裂紋和多孔結構，特別是110℃時，杏鮑菇蛋白顆粒表面孔洞數量明顯多于其他處理，細小的裂紋也較多。本試驗的結果與陳世超觀察到的熱處理后蛋白質中的裂紋和孔隙相似。Mir等對藜麥分離蛋白（quinoa protein isolates，QPIs）進行熱處理后也觀察到這種現象。馬丹等也證實了大豆分離蛋白因熱處理而出現開裂和多孔結構。

2.4.2 圓二色性光譜

在蛋白質或多肽的二級結構中肽鍵是高度有規律排列的，根據其肽鍵排列的不同，二級結構不同的蛋白質或多肽，所產生的圓二色譜的譜帶位置、峰的強弱均不同。因此，根據所測得的蛋白質或多肽的圓二色性光譜（circular dichroism spectrum，CDS），能反映出蛋白質或多肽鏈的二級結構位置。杏鮑菇蛋白的圓二色譜見圖3。

圖3 不同干熱處理溫度對杏鮑菇蛋白圓二色譜的影響Fig.3 Effect of different dry heat treatment temperatures on circular dichroism spectra of Pleurotus eryngei protein

由圖3可知，未經干熱處理的杏鮑菇蛋白的CD譜在208 nm處有明顯的負峰，在195 nm處有正峰，說明存在α-螺旋構象的特征。隨著溫度的升高，65℃和80℃時，208 nm和222 nm處的負峰增強，意味著α-螺旋的百分比增加。溫度超過80℃以后，隨著溫度的升高，208 nm和222 nm處的負峰明顯減弱。同時，80℃時杏鮑菇蛋白在216 nm時具有最強的正峰，說明β-折疊所占的比例最低。在220 nm附近處有一正峰，表明該蛋白中含有無規卷曲結構，在110℃時正峰最不明顯，說明此溫度下蛋白質的無規卷曲結構所占的比例最低。加熱后的杏鮑菇蛋白譜線在208 nm處向長波長方向移動，即發生紅移。由于發色團吸收光譜發生位移主要取決于它的微環境更加親水或疏水的結果，因此紅移的發生說明體系的親水性增加，疏水性下降。此現象與上述測得的疏水性在110℃時發生下降的現象相符，出現該現象的原因或許是蛋白質分子發生無規則聚集形成較大的分子，而使疏水基團聚集在大分子內部，隱藏了疏水性位點。而低于100℃時，隨著溫度的升高，疏水性逐漸升高的現象，或許是由于蛋白質分子得以展開，α-螺旋結構所占的比例較高，增大了疏水性位點的暴露。在100℃的范圍內本研究現象與Miyazawa對藜麥分離蛋白進行熱處理觀察到的結果相似，但其對100℃以上的加熱溫度并未進行研究。

2.4.3 紫外光譜分析

采用紫外分光光度法分析熱處理對杏鮑菇蛋結構的影響。由于色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、硫氨酸、半胱氨酸和肽鍵對紫外線的吸收，使蛋白質可以在280nm左右處出現吸收峰。不同處理組杏鮑菇蛋白質的紫外光譜見圖4。

圖4 不同干熱處理溫度對杏鮑菇蛋白紫外光譜圖的影響Fig.4 Effect of different dry heat treatment temperature on UV spectrum pattern of Pleurotus eryngii protein

由圖4可知，在80℃時吸收峰最大，說明在80℃時暴露的氨基酸和肽鍵數量最大，在95℃和125℃時其紫外吸收強度出現了低于未處理蛋白的吸收強度。出現該現象的原因可能是因為熱處理使蛋白質發生變性，使其三級結構得以展開，內部基團得以暴露，隨著溫度的進一步升高，在95℃時紫外強度發生下降，這種轉變或許是由于展開的蛋白質小分子進一步發生聚集，使功能基團被包裹在內部。何興芬研究熱處理對藜麥蛋白三級結構的影響時發現隨著溫度的升高和時間的延長，在121℃、30 min時其紫外吸收強度達到最低值，與本研究所得結果相似。

3 結論

通過研究發現，不同干熱處理溫度可以影響杏鮑菇蛋白質的結構，結構的改變對蛋白質功能有不同的影響。95℃處理30 min，蛋白質的大部分功能特性均能得到改善，但溫度的升高對杏鮑菇蛋白質二級結構的破壞逐漸增加，當溫度達到125℃時，蛋白質的功能特性普遍不如未處理的杏鮑菇蛋白質。杏鮑菇蛋白質干熱處理后結構和功能特性的變化為進一步研究干熱處理對杏鮑菇蛋白質加工特性的影響提供了參考。