骨蝕方治療股骨頭壞死的藥理學機制

魏 濤，鄧凱文，曾 勇，周紅典，李 漁，徐祖健

西南醫科大學附屬中醫醫院 骨關節科（瀘州 646000）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是股骨頭血液供應受損導致股骨頭內細胞死亡，從而引起病人出現關節疼痛及活動受限等臨床表現，是骨科中常見的多發性及難治性疾病[1-4]。據流行病學資料顯示，在美國和日本，每年分別有2 萬和1.2至2.4萬例新診ONFH病人，而在中國年齡大于15歲的人群中，累計約有812 萬例ONFH 病人，其中男性發病率（1.02%）明顯高于女性（0.51%），且在全世界范圍內發病率呈現出逐年遞增趨勢[5-6]。目前，對于ONFH 病因的認識可分為創傷性和非創傷性兩大類，前者主要包括股骨頭/頸骨折和髖臼骨折等，后者的病因更為復雜，主要有長期吸煙和過量酗酒、不規范使用糖皮質激素、肥胖、糖尿病和自身免疫性疾病等[5,7-9]。此外，ONFH對病人生活、心理和經濟造成的影響更是難以估量[10-13]。故積極探索治療此病的新方式已成為目前研究的熱點方向。

中醫學依據ONFH 的臨床表現，可將其歸于“骨蝕”和“骨痹”等范疇，其中瘀阻絡證和肝腎虧虛證又為臨床常見的兩種證型[14]。但由于骨蝕方藥物所含成分復雜，其作用機制尚待進一步闡明。因此，本文基于網絡藥理學探討骨蝕方治療ONFH的潛在作用靶點及分子學機制，擬為骨蝕方的臨床應用提供可靠的理論依據和科學基礎。

1 資料與方法

1.1 骨蝕方活性成分及靶點收集

通過TCMSP 數據庫收集骨蝕方中8味中藥的活性成分，首先分別以“延胡索”“續斷”“牛膝”“骨碎補”“獨活”“川芎”“白術”和“白芍”為關鍵詞逐一進行檢索，再以口服利用度≥30%同時成藥相似性≥0.18為閾值對上述藥物進行再次篩選，獲得骨蝕方有效活性成分信息，然后再次使用TCMSP 數據庫獲得活性成分所對應的靶點名稱，最后使用Uniprot 數據庫獲得靶點對應的基因，并將物種類型選擇為“human”。

1.2 股骨頭壞死治療靶點收集

首先分別通過Genecard 和OMIM 數據庫以“osteonecrosis of the femoral head”為關鍵詞進行檢索，去重檢索結果后獲得ONFH 疾病的所有靶點，導入至Excel 對結果進行整合，然后利用R語言制作韋恩圖，獲得骨蝕方作用靶點并與上述靶點取交集，最后得到骨蝕方治療ONFH的潛在靶標。

1.3 構建化合物-靶點-疾病網絡

首先將治療ONFH疾病的靶點與骨蝕方治療靶點同時導入至Excel 合并，對結果重復值導入至新的Excel表格，此結果即為骨蝕方治療ONFH的靶點，然后將上述結果導入至Cytoscape 3.7.2 軟件獲得骨蝕方與治療靶點的互作網絡圖。

1.4 蛋白互作網絡（PPI）構建

首先將骨蝕方治療ONFH 的潛在靶點依次導入STRING 數據庫，然后導入至Cytoscape 3.7.2 軟件將結果以可視化形式展現出來。

1.5 GO生物功能與KEGG 信號通路富集分析

將骨蝕方治療ONFH 的交集靶點利用R 語言，條件設定為P ≤0.05 進行KEGG 和GO 富集分析，并選擇前20條結果繪制柱狀圖。

2 結果

2.1 骨蝕方化合物-ONFH靶點-疾病網絡構建

通過TCMSP數據庫檢索骨蝕方治療ONFH的活性成分靶標，剔除檢索出的重復結果后得到：延胡索8個，續斷3 個，牛膝6 個，骨碎補7 個，獨活4 個，川芎5個，白術3 個，白芍4 個。其中谷甾醇為白芍、川芎、延胡索的共有成分；山奈酚為白芍、骨碎補、牛膝的共有成分；豆甾醇為骨碎補、牛膝、熟地黃、延胡索的共有成分；槲皮素為牛膝、延胡索的共有成分；β-谷甾醇為獨活、骨碎補、牛膝、續斷共有成分。對Genecard 和OMIM 數據庫中獲得的ONFH 相關基因取并集，得到ONFH 相關基因739 個。將骨蝕方候選靶標與ONFH候選靶標相比較，得到可能與治療ONFH 的作用靶標121個，并繪制韋恩圖展示（見圖1）。將骨蝕方活性成分和與ONFH相關靶標同時導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建化合物-靶點-疾病網絡圖，圖中包括158個節點。骨蝕方治療ONFH具有多成分和多靶標等特點（見圖2）。

圖1 骨蝕方與ONFH靶點韋恩圖Figure 1 Venn diagram of Gushi Fang and targets of ONFH

圖2 骨蝕方治療ONFH的“藥物-靶點-疾病”網絡圖Figure 2 "Drug-Target-Disease"network diagram of ONFH treated with Gushi Fang

2.2 靶蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖

將骨蝕方治療ONFH 作用靶點導入STRING 蛋白互作網絡數據庫，再將得到的靶蛋白互作圖導入Cytoscape 3.7.2 軟件。結果共計158 節點，515 條邊（見圖3）。連接度位于前30 的靶點作為骨蝕方治療ONFH的核心靶點，其中排名前4 的包括白介素6（Interleukin 6,IL-6）、AKT1、VEGFA、MAPK3和JUN。提示這4個靶標基因是骨蝕方治療ONFH 的重要基因（見圖4）。

圖3 骨蝕方治療ONFH的PPI網絡Figure 3 PPI network of ONFH treated with Gushi Fang

圖4 骨蝕方治療ONFH的核心靶點Figure 4 Core targets of ONFH treated with Gushi Fang

2.3 GO生物功能與KEGG 信號通路富集分析

GO 功能富集出生物過程總計140 條，結果取排名前20（見圖5）。KEGG 信號通路富集出相關通路總計157 條，結果取排名前20（見圖6）。分析結果表明，骨蝕方治療ONFH 的靶點主要涉及細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、信號轉導受體激活（signaling receptor activator activity）、IL-17信號通路（Interleukin-17 signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）以及P13K-Akt信號通路（P13K-Akt signaling pathway）等。

圖5 骨蝕方治療ONFH靶點基因GO功能富集圖Figure 5 GO function enrichment map of the target genes of ONFH treated with Gushi Fang

圖6 骨蝕方治療ONFH靶點基因KEGG功能富集圖Figure 6 KEGG functional enrichment map of target genes of ONFH treated with Gushi Fang

3 討論

目前對ONFH的治療方式主要包括手術治療和保守治療兩類，手術治療方式的選擇又是多種多樣，各有優劣，其中髓芯減壓術和鉭棒植入術雖然對疾病分期較早的病人療效顯著，但對于分期較晚者常常難以達到緩解臨床癥狀的目的；而髖關節置換術雖然是治愈病人的有效方法，但作為異體結構，存在后期再次換髖和翻修的可能，加之手術風險和較高的手術費用使病人對手術治療的接受度相對較低[15]。另外，保守治療又分為藥物治療和物理治療，前者主要有應用雙膦酸鹽抑制骨吸收，促進新骨生成，但對于此藥的最佳使用濃度尚存爭議；抗凝藥物和血管擴張劑的應用能有效改善病灶處血液供應，預防塌陷等特點，但對于有出血風險的病人而言又限制了此類藥物的使用；體外沖擊波療法和脈沖電磁療法為治療ONFH 常用的物理方式，主要通過促進病灶處血管生成、刺激成骨起到增加骨量等作用，而高壓氧治療可增加氧含量，改善微循環，并誘導新生血管形成，但目前相關報道較少，療效有待大樣本臨床研究驗證[16-17]。

中醫在治療ONFH 方面具有獨特優勢，對早期病人的治療效果甚至優于手術治療[18-19]。骨蝕方作為治療ONFH 的特色方劑，通過長期觀察發現骨蝕方在改善病人疼痛和提高關節活動度等方面療效確切。本方重用續斷和牛膝為君藥，補腎強骨的同時兼顧活血通經，考慮本病病程較長，久病入絡，故配伍延胡索為臣藥，止痛行氣之余兼活血之功，同時佐以骨碎補、獨活和川芎加強諸藥補腎活血之力，最后施以少量白術和白芍健脾柔肝，以上藥物合用共奏補腎強骨、活血止痛之效，故“骨蝕”自愈也。此外，結合本網絡藥理學結果，我們推測骨蝕方通過調節IL-17、TNF 以及P13KAkt信號通路發揮治療ONFH的作用。IL-17和TNF作為重要的促炎性因子，相比健康人群，在ONFH病人血清中含量較高，故以IL-17和TNF為治療靶標成為目前治療ONFH 的新思路[20-23]。亦有研究證實，通過激活P13K-Akt信號通路能促進股骨破骨細胞的重吸收，對改善股骨的骨顯微參數具有積極作用[24-26]。同時，P13K-Akt信號通路在既往研究中表明，在心肌缺血再灌注中可以通過恢復細胞抗凋亡、促進肌漿網對Ca2+再攝取途徑保護心肌[27]；也有研究表明P13K-Akt 信號通路可通過調控股骨血管信號通路活性，促進病灶血管修復，也可通過誘導成骨細胞增殖、抑制破骨細胞活性，從而調節二者比值，參與到治療ONFH 疾病的過程[28-31]。

4 結論與后續驗證

通過網絡藥理學結果得知，骨蝕方治療ONFH 的藥理學機制可能通過谷甾醇、豆甾醇、槲皮素和β-谷甾醇等成分，作用于IL-6、AKT1、VEGFA、MAPK3 和JUN 等靶點和IL-17、TNF 以及P13K-Akt 等信號通路，發揮抗炎、調節成骨/破骨細胞比值等而發揮治療作用。后續，我們將結合本研究結果開展一系列實驗驗證骨蝕方治療ONFH的具體作用機制。

（利益沖突：無）