腫瘤相關因子TSHR與甲狀腺乳頭狀癌的相關性

劉 俊 ,葉 靜 ,王 科，鐘 玲 ,魏雪梅

1.成都三六三醫院耳鼻咽喉頭頸外科（成都610041）；2.成都大學附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科（成都 610081）

甲狀腺乳頭狀癌（thyroid carcinoma,TC）是我國常見的惡性腫瘤，現在其主要治療方法是以手術治療為主[1]，同時給予碘131治療。隨著對甲狀腺乳頭狀癌研究的深入，該疾病發病的分子生物學機制逐漸成為了熱點。有研究指出[2]，甲狀腺乳頭狀癌的發病可能與多種基因如BRAF、P53等基因的突變和表達水平變化有密切關系。但是作為甲狀腺疾病相關基因，TSHR因子在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達對其發生、發展、轉歸的研究并不十分多見。因此，對甲狀腺乳頭狀癌的相關基因TSHR的檢測對于防治甲狀腺乳頭狀癌，改善疾病預后具有重要意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象及材料

1.1.1 研究對象 選取2017年3月至2018年3月就診于本院的甲狀腺乳頭狀癌病人，并隨機抽取其中符合要求的病人30 例，納入標準：①符合甲狀腺癌診療規范（2018 年版），并通過成都三六三醫院病理科行病理活檢確定診斷；②病人自入院初未經過其他治療（如核醫學碘131治療）等；③年齡18歲以上，具有良好的依從性，并簽署知情同意書；本研究通過了倫理學審議（倫理審查號：JN.No20200630c0240731[119]）。排除標準：①經檢查發現其他惡性腫瘤，或已接受其他治療等；②已經發生遠處轉移的病人；③病人拒絕參與實驗。

1.1.2 實驗材料BCA試劑盒購自碧云天生物技術研究所；總mRNA提取試劑盒購自天根生物公司；反轉錄試劑盒購自Themo fisher公司；熒光定量PCR引物合成自上海生工公司（TSHR上游引物序列為5'-GCTTTCAGG TAAACCAATGA-3'下游引物為5'-AAGGGCCAGTGA CACTGGTTTGAGA-3'。BRAF上游引物為5'-TCGTC AATCGGTC-3'下游引物為5'-CGGCTTGCATT）；熒光定量PCR 試劑盒購自大連Takara 公司；TSHR 及BRAF 一抗抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗取材 納入對象行手術治療切除甲狀腺乳頭狀癌及周圍組織，標本送病理科進行活檢，確定甲狀腺乳頭狀癌癌組織病灶及未被腫瘤侵犯的組織，并將組織各分為兩份，分別置于-80 ℃冰箱及RNA 保護液中保存。

1.2.2 檢測mRNA 表達水平 使用天根總mRNA 提取試劑盒分別提取各標本總mRNA，經凝膠電泳紫外熒光顯色觀察28s RNA及18s RNA條帶清楚，且28s RNA大約為18s RNA 量的兩倍，說明RNA 完整性較好視為RNA 完整性良好（見圖1）。并通過紫外分光光度計確定OD260/OD280在1.8～2.1 之間的RNA 視為合格樣本。確定合格的樣本在定量后使用Themo公司逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，并置于-20 ℃長期保存。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性Figure 1 Integrity of RNA tested by agarose gel electrophoresis

使用聯排PCR 管，每管加入解凍后的cDNA 溶液1 μL，無菌去離子水7 μL，正反鏈引物各1 μL，熒光染料10 μL，并置于RT-qPCR 儀中，以50 ℃2 min，95 ℃10 min，（95 ℃15 s，60 ℃1 min）×40 循環，95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s的程序運行，得到結果與內參對比后得出△Ct后進行分析。

1.2.3 檢測蛋白質表達量 取約1 g 解凍后組織加入1%PMSF，研磨裂解沉淀后，14 000 r/min離心10 min取上清液，-20 ℃保存，并使用BCA試劑盒及酶標儀測定樣本蛋白質含量并統一定量后置于-20 ℃保存。取15 μL 組織總蛋白加入等量loading buffer，100 ℃水浴30 min，行恒壓電泳后轉至PVDF 膜，并加入5 mL TBST，一抗2 μL，脫脂奶粉0.4 g 配置的封閉液，混勻30 min 后4 ℃孵育過夜。次日清洗PVDF 膜后曝光顯像。

1.3 數據分析 采用SPSS 18.0 對實驗結果進行分析，正態分布計量資料采用ˉX±S表示，兩個樣本均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌與正常組織中mRNA的表達

2.1.1 TSHR mRNA在正常組織與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達差異 正常組織中TSHR mRNA的△Ct值為11.783±0.21，而甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR mRNA的△Ct值為8.189±0.42（見圖2），甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR的mRNA表達較正常組織升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 TSHR mRNA在正常組織與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達Figure 2 Expressions of TSHR mRNA in normal tissue and PTC tissues

2.1.2 BRAF mRNA 在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達差異 正常組織中BRAF mRNA的△Ct值為7.478±0.35而甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF mRNA的△Ct值為5.216±0.47（見圖3），甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF的mRNA表達較正常組織升高，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 Braf mRNA在正常組織與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達Figure 3 Expressions of Braf mRNA in normal tissue and PTC tissues

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織與正常組織中的蛋白表達

2.2.1 TSHR 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達差異 正常組織中TSHR 蛋白TSHR/β-actin相對灰度值為0.955±0.12，甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR/β-actin 相對灰度值為1.452 ± 0.09（見圖4，圖5），甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR蛋白表達較正常組織升高，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 TSHR 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達Figure 4 Expressions of TSHR protein in normal tissue and PTC tissues

圖5 TSHR 蛋白在正常組織與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達柱狀圖Figure 5 Bar chart of expressions of TSHR protein in normal tissue and PTC tissues

2.2.2 BRAF 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達差異 正常組織中BRAF 蛋白BRAF/β-actin 相對灰度值為1.721 ± 0.09，甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAF/β-actin相對灰度值為2.012 ± 0.13（見圖6,圖7），甲狀腺乳頭狀癌BRAF 蛋白較正常組織升高，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖6 BRAF 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達Figure 6 Expressions of BRAF protein in normal tissue and PTC tissues

圖7 TSHR 蛋白在正常組織中與甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達柱狀圖Figure 7 Bar chart of expressions of TSHR protein in normal tissue and PTC tissues

2.2.3 BRAF 基因與TSHR 基因表達的相關性 將QPCR 分析所得TSHR與BRAF基因表達結果通過SPSS 18.0 進行相關性雙變量分析后，發現TSHR表達與BRAF表達呈正相關,r 值為0.799（見圖8），且差異具有統計學意義（P＜0.05）

圖8 TSHR與Braf 蛋白表達相關性散點圖Figure 8 Correlation between THSR and Braf protein

將Western-bolting 分析所得TSHR與BRAF基因表達結果通過SPSS 18.0進行相關性雙變量分析后，發現TSHR表達與BRAF表達呈正相關,r 值為0.904（見圖9），且差異具有統計學意義（P＜0.05）

圖9 TSHR與Braf mRNA表達相關性散點圖Figure 9 Correlation between THSR and Braf mRNA

3 討論

甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤總病例的1%，是近年來發病率增長較快的實體腫瘤[3]。有報道指出，全球2018 年估計新發567 000例,死亡41 000 例，其發病趨勢在世界范圍內快速上升[4]。在我國，甲狀腺癌亦是常見的惡性腫瘤，其發病率亦快速上升[5-6]。而甲狀腺乳頭狀癌則是甲狀腺癌中最常見的類型[7]。有報道指出，甲狀腺乳頭狀癌的發病可能與輻射、激素水平、碘攝入量等因素有關[4,8-9]，但其發病的分子生物學機制并沒有被完全揭示。

隨著分子生物學技術的進步及對甲狀腺乳頭狀癌研究的不斷深入，有報道指出甲狀腺乳頭狀癌與多種基因如BRAF、P53等基因的突變和表達差異有密切關系[10-12]。其中TSHR基因突變與甲狀腺乳頭狀癌發生、發展及轉歸的關系逐漸引起人們的關注[13]。作為甲狀腺疾病的相關因子，TSHR基因的變異與表達的變化與以Graves 病、橋本氏甲狀腺炎為代表的眾多甲狀腺疾病有關[14-15]。作為調控甲狀腺細胞代謝的關鍵因子，TSHR基因的表達受到多種基因的表達調控[16-19]。在作用機制上，TSHR 作為G 蛋白偶聯受體家族成員，對甲狀腺細胞分化起到了重要的調節作用，TSH與TSHR相偶聯，激活異源三聚體G 蛋白介導TSHR 信號，同時引發cAMP級聯反應，進而控制了甲狀腺乳頭狀癌相關基因的表達并影響了甲狀腺腫瘤及相關疾病的發展[20-21]。同時有研究認為，甲狀腺乳頭狀癌中，RASSF1A、P16啟動子甲基化率明顯增高[22]，此時促甲狀腺激素TSH與位于甲狀腺表面的TSHR相結合，引發TSHR表達變化，引發碘攝入及甲狀腺素合成變化，進而影響甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展。

傳統的觀點認為，TSHR作為抑癌因子，對甲狀腺乳頭狀癌尤其是合并甲亢的乳頭狀癌的進展起到了抑制的作用[14,24-25]，這與本次實驗結果中甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR表達量較正常組織明顯升高相悖。但同時有報道認為，甲狀腺乳頭狀癌病人TSHR基因表達較正常病人高[19,26-27]。上述研究認為，甲狀腺乳頭狀癌病人THSR基因高表達可能與甲狀腺腫物導致甲狀腺功能亢進有關，同時該現象可能與BRAF基因的高表達相關[28-30]。這些觀點，與本研究中甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR與BRAF表達呈正相關關系的結論相同。但其并未對合并甲亢的甲狀腺乳頭狀癌出現的上述情況做詳細解釋，同時其未對甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR的進行相關檢測。本研究認為，甲狀腺乳頭狀癌中THSR高表達可能是由于甲狀腺惡性腫瘤的發生及進展刺激了TSHR被動表達，進一步引起上述表現。

甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展受到了多基因的調控。但對于TSHR基因，更多的研究著眼于TSHR啟動子甲基化率[31]及外周血中TSHR-mRNA表達[32]與甲狀腺乳頭狀癌的相關性。目前為止，僅有極少研究對TSHR基因在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常組織中的表達變化進行研究[33]，且上述少量研究并未通過Westen-Bolting 等分子生物學方法對TSHR基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達進行精確的定量[31]。于此，我們采取Q-PCR及Western-Bolting方式對TSHR基因進行檢測，并將檢測結果與腫瘤相關因子BRAF基因的表達進行比較。實驗結果表明：甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR表達量較正常組織明顯升高，同時，甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR表達與作為參考基因的BRAF表達亦呈正相關關系，進一步揭示了TSHR基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中發生、發展中起到的作用。

4 結論

甲狀腺乳頭狀癌細胞中TSHR 因子的表達水平較正常組織顯著升高，且與BRAF 的表達呈正相關關系，其成因可能與甲狀腺乳頭狀癌的進展刺激TSHR 的被動表達有關，以致進一步引起TSHR的高表達。

（利益沖突：無）