線粒體分裂抑制劑-1在香煙誘導小鼠氣道炎癥與氧化應激中的作用機制

劉軍輝，胡雪茹，曾婷婷，王肖宇，陳秋貝，郭恒盧，丹 宜，申永春，文富強

四川大學華西醫院 呼吸與危重癥醫學科/生物治療國家重點實驗室呼吸病學研究室（成都，610041）

慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種慢性進展性肺部疾病，不完全可逆性氣流受限為其主要特征，存在顯著的氣道炎癥、肺氣腫及肺部結構和功能受損[1]。慢阻肺的發病機制非常復雜，其中香煙暴露是慢阻肺最重要的危險因素，香煙煙霧可誘導氣道上皮釋放炎癥介質活化炎癥細胞促進炎癥反應,活化的炎癥細胞釋放的過多應激氧化產物同香煙中的氧化劑、自由基增強氧化應激反應，繼而產生持續性的慢性炎癥，促使黏液高分泌、支氣管周纖維化及肺泡壁破壞是慢阻肺發生的主要病理機制[2-3]。因此對香煙誘導的炎癥和氧化應激進行系統研究有望為慢阻肺尋找到新的干預靶點與藥物，具有重要的臨床意義。

近年來不斷有研究顯示線粒體結構和功能紊亂參與了慢阻肺的發生發展[4-5]，文獻報道線粒體動力學的異常可能是慢阻肺發病機制的一部分，但具體機制尚不明確[6]。線粒體融合和分裂處于動態平衡中，在香煙等外界因素的刺激下，可能會導致線粒體融合和分裂的失衡，導致線粒體結構和功能的改變，進而參與炎癥、氧化應激等病理生理過程[7]。圍繞線粒體功能進行研究與藥物研發，有望為慢阻肺的治療尋找到新的藥物。近年來越來越多的研究關注到Drp1，一種動力蛋白家族GTP 酶，Drp1 表達增加，線粒體分裂增加，網狀結構破壞，是介導線粒體分裂的主要蛋白，研究表明Drp1的高表達與炎癥、氧化應激密切相關[8-9]。線粒體分裂抑制劑1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）是一種喹唑酮衍生物，通過阻斷Drp1在線粒體外的成環來抑制其GTP 酶活性以減少線粒體過度分裂，是一種選擇性線粒體分裂抑制劑[10]。研究顯示Mdivi-1通過抑制Drp1轉位到線粒體，減輕線粒體功能障礙和氧化應激對急性脊髓大鼠起保護作用[11]。最近研究Mdivi-1通過抑制絲裂原活化蛋白激酶、氧化應激和細胞凋亡減輕脂多糖誘導的急性肺損傷[12]。這些研究均提示Mdivi-1具有良好的抗炎癥、抗氧化應激藥理學效應，具備一定的臨床應用前景，本研究擬探索Mdivi-1對香煙誘導的小鼠氣道炎癥和氧化應激是否具有保護作用，并探討其相關的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物模型及分組

實驗采用江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供的雄性、清潔級C57BL/6J 小鼠（8～10 周齡，體重20～25 g）。實驗小鼠共分為4組，對照組小鼠不做任何處理；藥物對照組小鼠僅在腹腔注射Mdivi-1；單純熏煙組僅接受香煙熏煙；實驗組小鼠腹腔注射Mdivi-1后再接受香煙熏煙，該組小鼠熏煙前半小時腹腔注射給藥1次，給藥劑量50 mg/kg，每次熏煙75 min，每天熏煙2次，每周5 d，熏煙裝置為經鼻自動熏煙裝置，連續熏煙4周后腹腔注射1%苯巴比妥（50 mg/kg）處死小鼠后收集樣本[13]。本研究符合善待實驗動物要求，并經醫院倫理委員會審核同意。

1.2 肺泡灌洗液收集及細胞計數

夾閉小鼠右氣管下段，置入小鼠專用留置針，注入0.5 mL冰PBS，觀察到左肺完全膨脹，說明灌洗液已經進入左肺，停留3～5 s 后，低速緩慢回抽，回收至少90%灌洗液，此操作重復3 次。將收集的肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage fluid，BALF）在4 ℃、1000 g 條件下離心5 min，離心后得到的細胞沉淀進行細胞總數及分類計數。

1.3 BALF炎癥因子測定

酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒對BALF 中的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（欣博盛，深圳）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）（伊萊瑞特公司，武漢）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）（伊萊瑞特公司，武漢）濃度進行檢測，按照說明書的步驟實施檢測。

1.4 HE染色

左側未經灌洗的肺組織經固定、透明、蠟浸、包埋處理，以4 μm 厚度切片，常規進行HE 染色，光學顯微鏡下觀察氣道及支氣管周圍肺組織的變化，并由一名經驗豐富且對實驗干預及分組未知的實驗人員對肺部炎癥損傷進行評分[11]。

1.5 氧化應激水平測定

從液氮罐中取出保存好的肺組織，制成10%勻漿，按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書檢測肺組織勻漿中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.6 生物信息分析

在PubChem 數據庫檢索出已公開發表的Mdivi-1作用靶點基因，使用基因序列分析軟件R 語言進行生物信息分析，包括基因本體（Gene Ontology,GO）分析：富集出基因的生物過程、細胞成分和分子功能。信號通路分析：使用京都基因和基因組百科全書數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集基因參與的通路。

1.7 Western Blot

取出凍存于液氮罐的肺組織，提取肺組織總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），轉膜，BSA 封閉，1 h后分別加入一抗P-P-65、P-65、IκBα、P-IκBα、Drp1、Mfn2、GAPDH（1∶1000），置于4℃孵箱中孵育過夜，洗膜，并加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000）,顯影，使用灰度檢測軟件ImageJ（National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA）分別測定目的蛋白、內參蛋白灰度值。用目的條帶灰度值/GAPDH 灰度值作為該目的蛋白的相對含量，用磷酸化蛋白灰度值/總蛋白灰度值作為該磷酸化蛋白的相對含量，再用統計軟件對相對含量進行統計處理及分析。

1.8 統計學分析

所有值都表示為平均值±標準差，使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統計分析，費爾希最低顯著性差異檢驗（Fisher’s LSD）進行多重比較。使用R語言（3.6.3 版本）分析數據并準備圖形。P＜0.05 被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Mdivi-1 緩解香煙誘導的小鼠肺組織病理改變及氣道炎癥評分

與對照組比較，熏煙組可見明顯小鼠支氣管周圍炎性細胞浸潤，管腔阻塞,氣道上皮細胞增生，氣道上皮增厚，然而Mdivi-1 藥物對照組未見上述改變明顯，給予Mdivi-1干預可緩解前述改變，并能改善香煙誘導的氣道炎癥評分（圖1）。

圖1 Mdivi-1緩解香煙誘導的小鼠肺組織病理改變及氣道炎癥評分Figure 1 Mdivi-1 alleviated CS-induced histopathological changes of lung tissue in mice and scores of airway inflammation

2.2 Mdivi-1 減輕香煙誘導氣道炎癥細胞激活與炎癥因子釋放

與對照組比較，熏煙組小鼠BALF 中的總細胞、中性粒細胞數目顯著增加，給予Mdivi-1預處理顯著降低了香煙誘導的小鼠BALF中總細胞、中性粒細胞數量上升，熏煙組小鼠BALF中的巨噬細胞較對照組比較明顯上升，但是與實驗組相比無統計學差異（圖2）。

圖2 Mdivi-1減少香煙誘導的小鼠肺內炎性細胞浸潤Figure 2 Mdivi-1 reduced CS-induced inflammatory cell infiltration in mouse lungs

2.3 Mdivi-1減輕香煙誘導氣道炎癥因子釋放

小鼠在香煙暴露4 周后，BALF 中的TNF-α、IL-6及MMP-9 釋放數量較對照組顯著增加，而Mdivi-1 藥物對照組較對照組無明顯改變。Mdivi-1 預處理能顯著減少氣道內TNF-α、IL-6 的釋放（圖3A,B），實驗組MMP-9 較熏煙組有下降趨勢，但是無統計學意義（圖3C）。

圖3 Mdivi-1減少香煙誘導的小鼠肺泡灌洗液炎癥因子釋放Figure 3 Mdivi-1 reduced CS-induced release of inflammatory cytokines in the BALF

2.4 Mdivi-1減輕香煙誘導的氧化應激狀態

香煙暴露4周后,小鼠肺組織SOD活性顯著低于對照組，MDA 水平顯著高于對照組，Mdivi-1 預處理能顯著增強SOD活性，減低CS誘導的MDA水平的升高（圖4A,B）。

圖4 Mdivi-1緩解香煙誘導的小鼠肺內氧化應激Figure 4 Mdivi-1 alleviated CS-induced oxidative stress in mouse lungs

2.5 生物信息分析

共檢索到Mdivi-1 的潛在作用基因100 個，GO 分析富集生物學過程（BP）、細胞成分（CC）、生物學過程（BP）、分子功能（MF）及KEGG 信號通路富集到主要通路見圖5，其中富集到的生物學過程有線粒體結構調節、線粒體自噬及凋亡，富集到的主要的信號通路有Tnf、Mtor、Ampk、Adipocytokine及Nod-Like受體信號通路。

圖5 Mdivi-1潛在作用基因GO分析和KEGG分析富集氣泡圖Figure 5 GO and KEGG analysis of Mdivi-1 affected genes

2.6 Mdivi-1抑制了香煙誘導的NF-κB信號通路激活

KEGG 分析富集到了Tnf 信號通路，它包括NFκB、JNK、MARK等信號通路[14]，此部分實驗目的是選擇其中NF-κB 通路進行驗證。小鼠香煙暴露4 周后顯示：香煙誘導NF-κB 通路蛋白P-65，IκBα 的磷酸化水平升高，P-P-65/P-65 及P-IκBα/IκBα 相對定量升高。Mdivi-1預處理明顯抑制香煙誘導P-65及IκBα蛋白的磷酸化（圖6）。

圖6 Mdivi-1抑制香煙誘導小鼠肺組織內NF-κB的激活Figure 6 Mdivi-1 inhibited cigarette smoke-induced activation of NF-κB in mouse lungs

2.7 Mdivi-1改善香煙誘導的線粒體功能障礙

小鼠香煙暴露4周后顯著降低了肺組織線粒體融合蛋白Mfn2的表達，增加了線粒體分裂蛋白Drp1的表達，導致線粒體功能障礙，而給予Mdivi-1 預處理可減輕此現象（圖7）。

圖7 Mdivi-1改善香煙誘導小鼠肺組織線粒體功能障礙Figure7 Mdivi-1 improved cigarette smoke-induced mitochondrial dysfunction

3 討論

本實驗探討了線粒體分裂抑制劑Mdivi-1 在香煙誘導的小鼠氣道炎癥及氧化應激模型中的作用及其相關機制。實驗結果顯示，Mdivi-1可顯著改善香煙誘導的氣道炎癥與氧化應激反應，機制探索顯示Mdivi-1預處理可抑制香煙誘導的p-65及IκBα磷酸化，從而抑制NF-κB信號通路激活，并且Mdivi-1預處理可下調線粒體分裂蛋白Drp1 的表達,上調線粒體形態融合蛋白Mfn2 表達以改善線粒體功能，為探索Mdivi-1 在以慢阻肺為代表的慢性氣道炎癥性疾病中的運用提供了新的探究證據。

香煙中的有毒顆粒物引起慢性氣道炎癥，是慢阻肺重要的發病機制，炎癥引起氣道及肺結構的破壞及重塑，導致不可逆的氣流受限[2，15-16]。炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-18 及MMP-9 通過激活中性粒細胞、巨噬細胞、輔助性Th1、Th17 淋巴細胞，在炎癥的觸發和擴大起了關鍵作用[2,15-16]。中性粒細胞是香煙誘導氣道炎癥的重要效應細胞，中性粒細胞也可以釋放多種促炎介質，包括細胞因子、趨化因子和氧化劑，并可通過釋放內源性損傷相關分子模式和髓過氧化物酶驅動的亞硝酸鹽，誘導慢阻肺病人下氣道的細胞損傷[17]。本實驗給予Mdivi-1 干預可顯著抑制香煙誘導的氣道炎癥因子釋放（TNF-α、IL-6）和炎癥細胞（中性粒細胞）數目增加，表明Mdivi-1 改善了香煙誘導的氣道炎癥反應。在本研究中，雖然沒有觀察到Mdivi-1顯著降低BALF 中的巨噬細胞，但是仍觀察到了其下調趨勢，巨噬細胞在氣道炎癥中處重要位置，巨噬細胞分泌多種趨化因子和細胞因子，如TNF-α，誘導內皮細胞表達粘附分子，促進多種炎癥細胞的遷移[18-19]。既往的研究表明MMP-9可能與氣道炎癥與粘液高分泌有關，在慢阻肺的發病機制中具有一定的作用[20-21]，Mdivi-1 干預組MMP-9水平較熏煙組雖然沒有統計學差異，但是仍具有較明顯的下降趨勢。這些結果提示Mdivi-1 與氣道炎癥之間調控關系可能是復雜的，還需更深層次的研究其調控機制。

氧化應激在慢阻肺的發病機制起了重要作用[22]，氧化應激尤其是線粒體介導的氧化應激反應可導致蛋白質、脂質和DNA 的修飾，進而影響其功能，最終可導致細胞損傷及凋亡[5，22]。在本研究中，SOD 的活性及MDA 作為衡量氧化應激指標，給予Mdivi-1 干預可減輕香煙誘導的SOD 活性降低和MDA 積累，結果表明Mdivi-1改善了香煙誘導的氣道氧化應激反應，其抗氧化的效能使其具有治療氣道炎癥性疾病的潛能。

動物實驗顯示Mdivi-1 在小鼠體內發揮了抗炎及抗氧化作用，為尋找Mdivi-1在香煙誘導的氣道炎癥與氧化應激模型中潛在作用機制，本研究在PubChem 數據庫檢索Mdivi-1作用靶點，對相關基因進行生物信息分析，GO富集的生物過程為線粒體結構調節、凋亡、線粒體自噬等。香煙可誘導線粒體分裂及碎片化，線粒體結構及功能異常，與慢阻肺發病密切相關[23-24]。本次GO 分析富集了線粒體結構調節這一生物過程提示Mdivi-1 通過調節線粒體結構參與香煙誘導的氣道炎癥及氧化應激。本次研究再次證實，在香煙構建的小鼠氣道炎癥及氧化應激模型中Drp1表達上調，Mfn2表達下調，說明香煙促進線粒體的分裂，線粒體分裂可進一步損傷線粒體功能及介導炎癥。給予Mdivi-1 干預后可上調Mfn2 表達及下調Drp1 表達以促進線粒體融合，從而維持線粒體功能，改善氧化應激，降低炎癥反應。本次KEGG分析富集了Tnf信號通路，我們選擇其中的NF-κB通路進行驗證，并證實NF-κB通路可能參與了Mdivi-1 調控香煙誘導的氣道炎癥與氧化應激反應的進程，從側面印證了本次生物信息分析的可靠性。需要注意的是，本研究有一定的局限性，比如僅有動物實驗，未在體外探討Mdivi-1 對NF-κB 信號通路及線粒體功能的作用，未對其他富集的信號通路進行驗證等，未來還需要更多的研究進行驗證。

4 結論

Mdivi-1 可能通過抑制NF-κB 信號通路激活及改善線粒體功能對香煙誘導的小鼠氣道炎癥與氧化應激起到保護作用。Mdivi-1 有可能是治療香煙誘導的氣道炎癥性疾病比如慢阻肺的新藥物。

（利益沖突：無）