水羚源海藻伯氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

杜雪晴 ， 薩家祺 ， 陳 武 ， 吳亞江 ， 王 晨 ， 彭仕明 ， 單 芬

(廣州動物園 廣州市野生動物研究中心 ， 廣東 廣州 510070)

2020年10月，廣東某地圈養1只水羚(Kobusellipsiprymnus)發生以精神沉郁、運動遲緩、對反應遲鈍、食欲廢絕、漸進性消瘦、呼吸急促、氣喘等為主要癥狀的疾病，經2周治療無效后死亡。臨床剖檢可見患病水羚皮下脂肪較少，肺臟呈暗紅色，且可見廣泛性充血、瘀血，質地有明顯砂粒感。為探明病因，本試驗無菌采集患病水羚的肺臟組織開展病原菌培養、鏡檢和PCR鑒定，分離到1株疑似巴氏桿菌樣細菌，經鑒定為海藻伯氏菌(Bibersteiniatrehalosi)，并對分離菌株進行耐藥性、致病性、遺傳演化等分析，為水羚等大型草食動物的海藻伯氏菌疾病防控提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及實驗動物 廣東某地圈養患病后死亡的水羚，剖檢后無菌采集肺臟組織，由廣州動物園(廣州市野生動物研究中心)實驗室保存。SPF級BALB/c 小鼠，雄性，6～8周齡，體重約20 g，購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.2 試驗試劑 BUG培養基(用于自制BUG+B培養基)，購自Biolog公司；細菌基因組提取試劑盒，購自Omega Bio-Tek公司；DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)，購自Thermo Scientific公司；DNA Marker，購自廣州東盛生物科技有限公司；細菌鑒定試劑條，購自法國生物梅里埃股份有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑公司。

1.3 主要儀器 PCR儀、凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司產品；自動微生物鑒定系統，美國Biolog公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌分離及染色 用接種環蘸取病料分別接種于LB營養瓊脂及血平板，37 ℃培養箱培養18～24 h，觀察細菌的形態、大小和排列方式。24 h后挑取平板中的單個菌落進行抹片，革蘭染色鏡檢并記錄結果。

1.4.2 微生物鑒定儀分析及生化試驗 按照革蘭陰性菌Biolog自動微生物自動鑒定系統的鑒定參數選擇合適的培養條件，進行數據比對分析。具體方法：將單菌落接種到BUG+B培養平板上，37 ℃培養24 h，用無菌棉簽挑取少量新鮮菌落制成菌懸液，與標準菌懸液進行對照，濁度值誤差范圍在±2%以內，用八頭移液器將菌懸液分別加在鑒定板的各孔內，每孔接種菌懸液100 μL，加蓋，37 ℃培養24 h后打開微孔板蓋，將微孔板放入讀數儀中，開啟鑒定系統，計算機讀取數據，自動檢索數據庫并進行比對分析。取培養24 h后的細菌培養物分別接種到氧化酶、過氧化氫酶、D-海藻糖、D-麥芽糖、蔗糖、丙二酸鹽利用、5-酮基-葡糖酸鹽等微量生化管中，37 ℃培養24 h，觀察結果并記錄。

1.4.3 藥敏試驗 用滅菌環取純培養的菌株分別在LB瓊脂平板邊緣相對均勻4點涂菌，以每點開始劃線至平板的1/2，找到第2點劃線至平皿1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布。選取24種臨床常用抗菌藥物的藥敏片，將藥敏片貼到培養基平皿表面，在平皿中央貼1片，外周等距離貼若干片。將平皿置于37 ℃培養箱中培養12 h后，根據抑菌圈的大小判定菌株對藥物的敏感性。

1.4.4 16S rRNA基因鑒定及序列進化分析 設計細菌通用16S rRNA基因引物，引物序列Seq F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和Seq R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，預期片段大小約為1 500 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司廣州分公司合成。按細菌基因組提取試劑盒說明書進行DNA提取，以提取的DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：2×TaqMaster Mix 25.0 μL，ddH2O 19.0 μL，模板 2.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，總擴增體積為50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min; 94 ℃ 變性 40 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸1 min，共循環30次；72 ℃終延伸10 min。同時設模板滅菌水為陰性對照。取5 μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。陽性PCR產物送北京擎科生物科技有限公司廣州分公司進行序列測定。序列拼接后登錄NCBI進行BLAST分析，從GenBank中下載海藻伯氏菌的16S rRNA代表序列，采用MEGA 7.0進行序列進化分析并構建系統進化樹，應用Neighbor-joining法(參數設置為1 000 replications)和Maximum composite likelihood model比對核苷酸序列。

1.4.5 小鼠試驗 將分離菌株純培養物離心，棄上清液并用PBS溶液懸浮，試驗組5只小鼠每只腹腔接種菌液0.2 mL，對照組3只小鼠接種等量PBS溶液，觀察并記錄小鼠精神狀態及死亡情況，無菌采集死亡小鼠肺臟組織進行致病菌分離培養。

2 結果

2.1 分離菌株的培養特性 分離菌株在普通瓊脂平板培養24 h后，形成中等大小的菌落，菌落凸起、邊緣光滑、濕潤(圖略)。在血平板培養24 h后狀態良好，不溶血，形成灰白色、中等大小、凸起、光滑、濕潤、邊緣整齊的菌落(圖1)。挑取菌落進行革蘭染色，鏡檢發現為革蘭陰性球桿菌(圖2)。

圖1 分離菌株在血平板生長情況Fig.1 Colony morphology of the isolated strain in blood plate

圖2 分離菌株革蘭染色形態(1 000 ×)Fig.2 Gram straining micrograph of the isolated strain (1 000 ×)

2.2 分離菌株的生化特性 分離菌株的生化特性顯示：氧化酶、過氧化氫酶陰性；發酵D-海藻糖、D-麥芽糖、蔗糖、D-纖維二糖、D-山梨醇；不發酵D-葡萄糖、L-阿拉伯醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、側金盞花醇；酯酶、L-天冬氨酸芳胺酶、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、尿素酶、α-半乳糖苷酶、D-半乳糖酸鹽同化、丙二酸鹽利用、5-酮基-葡糖酸鹽產生等試驗均為陰性。經Biolog自動微生物鑒定系統鑒定，分離菌株為海藻伯氏菌(Bibersteiniatrehalosi)，可能值(PROB)為93.2%，相似性(SIM)為0.575，位距(DIST)為5.609，可以鑒定分離菌株的種名。

2.3 分離菌株藥敏試驗 采用24種臨床常用抗菌藥進行藥敏試驗，結果如表1所示。分離菌株對臨床常用治療藥物丁胺卡那、林可霉素等產生耐藥性，而對大環內酯類、喹諾酮類等抗菌藥較為敏感。

表1 分離菌株的藥敏試驗Table 1 Drug sensitivity test of the isolated strain

續表

2.4 分離菌株16S rRNA基因的PCR擴增 根據GenBank中細菌16S rRNA的基因序列，設計針對16S rRNA基因的擴增引物，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后獲得大小約1 500 bp的基因片段(圖3)，與預期片段大小一致。

圖3 分離菌株16S rRNA基因的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA gene of the isolated strainM：DNA分子質量標準； 1：檢測樣本； N：滅菌水對照M：DL2 000 DNA Marker; 1：Tested sample; N：Negative control

2.5 分離菌株16S rRNA基因序列的遺傳進化分析 將獲得的基因片段測序后登錄NCBI進行BLAST分析，結果與羊源海藻伯氏菌(GenBank登錄號:U57075)16S rRNA基因的核苷酸序列相似性最高，為99%。下載GenBank中已經報道的14株海藻伯氏菌和1株巴氏桿菌菌株(GenBank登錄號：E05329)的16S rRNA序列，構建基于16S rRNA基因的進化樹，結果顯示，分離菌株與其他9株不同地域的流行株位于同一個大的進化分支(Cluster Ⅰ)，而其他羊源菌株則形成另外一個小的進化分支(Cluster Ⅱ)(圖4)。

圖4 分離菌株16S rRNA基因的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene of the isolated strain?：本試驗分離菌株； ▲：巴氏桿菌菌株?：The strain isolated in this study； ▲：Pasteurella strain

2.6 小鼠試驗 腹腔注射細菌懸液后，試驗組5只小鼠均在3 h后出現食欲下降、活動減少等癥狀，6 h后開始出現死亡，8 h后試驗組小鼠全部死亡，剖檢可見肺臟出現充血、出血等癥狀，無菌采集小鼠肺臟進行菌株分離培養，均成功分離出海藻伯氏菌菌株，對照組小鼠均正常。

3 討論

海藻伯氏菌(Bibersteiniatrehalosi)是引起牛、羊等反芻動物肺炎的病原體[1]，常導致牛、羊、新生羔羊等發生嚴重的呼吸系統感染[2]，目前感染報道多見于美國、俄羅斯、英國等國家，國內僅見于山羊等動物[3]及1例人感染的簡要報道[4]。海藻伯氏菌的正式命名是在2007年，Blackall等[5]對該細菌的生化生理、形態特征和擴增性長度多態性片段等方面進行了系統研究后將其正式分為一個新的獨立細菌屬，命名為海藻伯氏菌。在此之前，其被劃為溶血性巴氏桿菌相同菌屬[6]。本試驗首次在國內圈養野生動物水羚體內分離到1株海藻伯氏菌，發病水羚出現明顯的肺炎癥狀，死亡剖檢可見肺臟出血等病理變化，經過細菌的分離培養和鑒定，初始發現疑似巴氏桿菌樣菌株，經過進一步的生化鑒定和分子生物學診斷，證實分離菌株為海藻伯氏菌。進行鑒別診斷時檢測了支原體、克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌等可能引起肺炎的病原體，均為陰性。

目前，國內關于海藻伯氏菌的報道僅限于汪斌等[4]報道的人感染該菌引起的腦膿腫、李富祥等[3]報道的山羊感染的案例，對該菌的深入研究報道較少。在動物致病性試驗中，本試驗分離菌株對小鼠呈現較強毒力，從死亡小鼠中也成功分離到該致病菌，筆者推測該菌可能是引起水羚死亡的原發病原，還有待進一步開展深入研究。

為指導臨床科學用藥，本試驗對分離菌株進行了藥敏檢測，結果顯示，該分離菌株對頭孢類、喹諾酮類、利福平、磺胺類等抗菌藥均敏感，而對林可霉素、丁胺卡那等常用抗菌藥產生耐藥。據了解，本病例在疾病治療初期曾多次采用丁胺卡那等抗菌藥進行治療，治療效果并不明顯，分析其原因：一方面在抗生素選擇壓力作用下，細菌的耐藥菌株越來越多[7-8]，菌株出現耐藥性是治療失敗一個非常重要的原因；另一方面是否存在混合感染或繼發感染，也是臨床治療中需要進行綜合考慮的要點，這可能也是治療效果不明顯的原因。

為佐證分離菌株的真實性，本試驗同時采用了細菌研究中常用的針對細菌16S rRNA基因的擴增及測序的研究方法，對分離菌株進行16S rRNA基因的擴增及測序。本試驗發現，分離菌株的16S rRNA基因核苷酸序列與NCBI中1株羊源海藻伯氏菌的16S rRNA基因的核苷酸序列相似性高達99%，從而進一步佐證了本分離菌株為海藻伯氏菌株。為更好地了解分離菌株的遺傳背景信息，通過下載GenBank數據庫中具有代表性的海藻伯氏菌16S rRNA基因序列，采用分析軟件進行基于16S rRNA基因的遺傳進化分析，結果顯示，本試驗分離菌株與美國、澳大利亞、瑞典等不同國家的9株不同宿主源的流行株位于同一個大的進化分支(Cluster Ⅰ)，而與我國之前報道的山羊源菌株(Cluster Ⅱ)存在明顯差異。因目前數據庫中可供參考的基因序列較少，究竟菌株的流行是否存在宿主特異性及地域關聯性，還有待進一步開展更多流行病學方面的調查與研究。