枯草芽孢桿菌利用玉米秸稈水解液生產乙偶姻

林源，秦偉帥，王佳琳，張娜，石林，王岱杰，孟武*

1(齊魯工業大學(山東省科學院)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南，250353) 2(齊魯工業大學(山東省科學院)生物工程學院，山東 濟南，250353)3(泰山學院 生物與釀酒工程學院， 山東 泰安，271000)4(山東省分析測試中心，山東 濟南，250000)

玉米秸稈作為一種天然生物質，其價格低廉、儲量巨大且對環境友好，可替代木材、炭等原料制備附加值更高的新型功能材料[1]。玉米秸稈富含半纖維素、纖維素和木質素等木質纖維素[2-3]。木質纖維素作為一種極具發展潛力的環境友好型資源，在制備生物質材料、能源與化學品領域等方面引起了廣泛的關注，研發出高效益和高效率的生物質水解方法可提高可再生木質纖維素生物質資源的利用和回收[4-5]。木質纖維素的預處理方法中，稀酸水解具有腐蝕性小，pH回調試劑需求量少，低成本、高工業價值和環境友好等優點，近年來一直是研究的熱點[6-7]。木質纖維素被稀酸水解后，碳碳鍵裂開，被水解為木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等糖類，可作為廉價原料生產生物質材料。提高木質纖維素的利用率，對生物質能源的研究具有重要意義[8]。

玉米秸稈包含了纖維素、半纖維素及木質素等纖維成分，是純天然的優質造紙原料，玉米秸皮的纖維素含量最高，有利于提高紙漿率和紙的強度，半纖維素含量適中，有利于紙漿的吸水，易于打漿，并且經稀酸水解后的殘渣中木質素含量較低，有利于蒸煮漂白，從而有利于紙張質量的提高[9]。

乙偶姻即3-羥基-2-丁酮，存在于香蕉、芒果、橘子、可可等水果中，具有特殊的奶油香味，是一種應用廣泛的食品添加劑，也是一種重要的化學工業的合成原料和醫藥中間體，具有較高的應用價值[10]。目前，乙偶姻有酶法轉換法、化學合成法和生物發酵法3種主要的生產方法[11]。其中，生物發酵法因原料獲得途徑較多，產品綠色天然、條件溫和、環境友好等優勢，應用較為廣泛。而生產原料作為乙偶姻產量非常重要的一個因素，近年來對其研究甚多，木質纖維素降解物則是一種工業生產乙偶姻的理想底物，具有很大的發展前景[12]。

本研究通過響應面設計研究了稀硫酸水解時間、水解溫度和硫酸濃度對玉米秸稈水解液中木糖、葡萄糖和阿拉伯糖含量的影響。在最佳水解條件下預處理玉米秸稈，并將脫毒脫色后的水解液與培養基結合，利用枯草芽孢桿菌發酵生產乙偶姻，并將水解后的秸稈殘渣預處理后用于造紙，實現玉米秸稈的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BS2，由齊魯工業大學(山東省科學院)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室保存。

1.1.2 培養基

根據秸稈水解液中碳源濃度(糖含量)，以LB培養基的營養成分為標準(氮源為主)，配制發酵培養基。

LB固體培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，瓊脂粉20，pH 7.2。

LB液體種子培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH 7.2。

發酵培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，(NH4)2SO48。

1.2 實驗試劑與儀器設備

硫酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氨水、(NH4)2SO4、NaCl，國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，上海源葉生物科技有限公司。

LC-20AD高壓液相色譜儀、GC-2030氣相色譜儀，日本島津公司；MQD-B3R恒溫振蕩培養箱，上海旻泉儀器有限公司；BBS-SSC超凈工作臺，濟南鑫貝西生物技術有限公司；U-6100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴槽，上海精宏實驗設備有限公司；E200M電子顯微鏡，京尼康江南光學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料處理和水解方法

將玉米干秸稈用粉碎機磨碎成秸稈粉末，精確稱取102 g的玉米秸稈粉末(平均含水率11.8%)于高溫耐壓反應釜中，按照固液比1∶10(g∶mL)的比例加入不同體積分數的稀硫酸[13-14]，在不同溫度下進行攪拌蒸煮(具體方案見表1)，冷水冷卻后經真空過濾分離水解液和固體殘渣(含纖維素、半纖維素)[15-17]。

表1 玉米秸稈的稀硫酸水解方案Table 1 Dilute sulfuric acid hydrolysis scheme of corn stoer

1.3.2 水解液處理

對稀酸水解玉米秸稈所得水解液進行脫毒脫色處理。將水解液煮沸15 min，添加氨水中和至pH=10，過濾，再滴加硫酸將pH回調至適當值，二次過濾，于25 ℃下真空蒸發濃縮至適當濃度，添加3%(質量分數)的活性炭脫色，80 ℃水浴30 min，再經抽濾后得到脫毒水解液，該方法可將水解液中的乙酸與糠醛全部除去。

1.3.3 發酵條件

菌株活化及種子液培養：用接種環取1環菌種接種到LB固體培養基中，37 ℃恒溫培養18 h，挑取單菌落于50 mL LB液體種子培養基，28 ℃、200 r/min振蕩培養12 h，按2%(體積分數，下同)接種量接到有50 mL LB液體種子培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min振蕩培養7 h，作為種子液。

搖瓶培養發酵：將種子液按6%的接種量接種到裝有200 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min振蕩培養8 d，發酵過程檢測各時間段的菌體生長特性和發酵表征。

發酵罐培養發酵：按6%的接種量將種子液接種到5 L自動發酵罐，裝液量2 L，28 ℃、200 r/min培養8 d，發酵過程檢測各時間段的菌體生長特性和發酵表征。

1.3.4 玉米秸稈水解殘渣造紙方法

稱取廢紙箱紙片2 g，高溫蒸煮后的玉米秸稈8 g。裝入纖維解離器的缸內，加水至刻度線，于纖維解離器中纖維解離后，打開凱塞抄片器，安裝造紙網，原料缸在紙頁成型器水刻度至3時倒入，待水排出后，用滾筒壓剛成型，紙張兩側用布包好后于凱塞抄片器上的真空干燥器中干燥10 min，獲得紙張成品。

1.3.5 分析方法

玉米秸稈水解前后表皮及內部結構采用電子顯微鏡拍照對比；采用高壓液相色譜儀測定木糖、葡萄糖、阿拉伯糖的含量[18]，分離柱Shodex Packed Column for HPLC(SHODO.CO.LTD)，柱溫80 ℃，以水為流動相，流速1 mL/min；利用頂空-氣相色譜法(headspace-GC，HS-GC)測定乙偶姻濃度，使用火焰離子化檢測器，進樣口檢測器溫度240 ℃；采用紫外分光光度計測定細胞生長的OD600值，監測細胞生長量。

1.4 數據處理與分析

以上實驗均重復3次，結果以平均值±標準偏差表示，數據處理采用SPSS軟件處理，制圖采用Origin軟件處理。

2 結果與分析

2.1 玉米秸稈酸水解的不同條件比較

2.1.1 水解條件對玉米秸稈表皮結構的影響

在不同條件下水解玉米秸稈，秸稈殘渣的微觀結構如圖1所示，圖1-a、圖1-e、圖1-c、圖1-f顯示出較高水解溫度對玉米秸稈纖維的破壞較為明顯，證明高溫可促進水解，但溫度>120 ℃時會破壞某些還原糖結構；圖1-b～圖1-d、圖1-f顯示出相同條件下，水解1 h后玉米秸桿的纖維結構變化不大，說明長時間水解不會對玉米秸稈纖維結構有太大影響；圖1-d、圖1-e反映出較高酸濃度的水解液也可促進水解。研究表明，較高溫度和較高水解液酸濃度條件下，可能對半纖維素水解效果更好，纖維素水解更均勻，但溫度和酸濃度過高反而會降解木糖、葡萄糖等還原糖[13]。

a-110 ℃,1.0%,1 h;b-110 ℃,0.8%,2 h;c-110 ℃,0.8%,3 h; d-120 ℃,0.8%,1 h;e-120 ℃,1.0%,1 h;f-120 ℃,0.8%,3 h圖1 水解處理后玉米秸稈表皮結構的電子顯微圖Fig.1 Electron micrograph of epidermal structure of corn stoer after hydrolysis treatment

2.1.2 水解條件對水解液中還原糖含量的影響

玉米秸稈水解液通過液相色譜法測定的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量見表2。采用110 ℃水解時，各還原糖含量并不高，且水解后的秸稈干重較低高，說明較低溫度不能更有效地水解玉米秸稈的木質纖維素。溫度到達120 ℃時，相同條件下比110 ℃得到的還原糖更多，當用1.0%(體積分數，下同)硫酸水解處理1 h，可獲得29.369 g/L木糖、14.316 g/L葡萄糖和48.631 g/L阿拉伯糖，且增加水解時間不能得到更多還原糖。

表2 水解液中各類還原糖含量Table 2 The content of arious reducing sugars in the hydrolyzate

對比本實驗設計的6個水解方案所獲得還原糖含量(圖2)，120 ℃、1.0%硫酸水解1 h時木糖、葡萄糖和阿拉伯糖產量均最多，總還原糖量同樣最多，并且水解秸稈干重也較高，說明秸稈中纖維素和半纖維素保留較好，水解殘渣經脫毒脫色處理后，可以用作造紙原料，因此為最佳水解方案[19]。

圖2 玉米秸稈水解液中還原糖含量對比Fig.2 Comparison of reducing sugar content in corn stoer hydrolyzate

2.2 枯草芽孢桿菌利用水解液發酵產乙偶姻

將玉米秸稈水解液與培養基結合后作為發酵培養基培養枯草芽孢桿菌，采用HS-GC測定發酵液中乙偶姻產量，如圖3和圖4所示。

圖3 枯草芽孢桿菌利用秸稈水解液發酵的乙偶姻產量、 發酵液pH、OD600和殘糖濃度Fig.3 Acetoin yield, pH of fermentation broth, OD600 and residual sugar concentration of B. subtilis using corn stoer hydrolyzate

圖4 枯草芽孢桿菌利用秸稈水解液發酵生產乙偶姻 過程中糖類消耗情況Fig.4 Sugar consumption during fermentation of corn stoer hydrolyzate by B. subtilis to produce acetoin

初始pH值為5.5，發酵初期，枯草芽孢桿菌首先以發酵培養基中的葡萄糖為主要原料，隨著時間延長，木糖和阿拉伯糖在葡萄糖消耗殆盡后作為主要碳源進入糖酵解過程生成丙酮酸，丙酮酸在乙酰乳酸合成酶作用下合成乙酰乳酸，乙酰乳酸繼而在乙酰乳酸脫氫酶催化下合成乙偶姻。當發酵至168 h時，乙偶姻獲得最高產量9.3 g/L，還原糖全部被利用，轉化率為0.44 g/g。

在5 L發酵罐實驗中，使用同樣的發酵培養基，裝液量為2 L，枯草芽孢桿菌代謝乙偶姻的發酵周期縮短，如圖5，乙偶姻產量在120 h時到達最高，為10.4 g/L，轉化率有所提高，為48.7%，120 h后產物產量基本不變。

圖5 發酵罐中枯草芽孢桿菌利用秸稈水解液發酵的 乙偶姻產量、發酵液OD600和殘糖濃度情況Fig.5 Acetoin yield，fermentation broth OD600，and residual sugar concentration fermented with corn stoer hydrolyzate by B. subtilis in a 5 L fermenter

從枯草芽孢桿菌發酵水解液生產乙偶姻的各個特征趨勢來看，玉米秸稈水解液可以作為一種有效、經濟的生物合成乙偶姻的原料，并且枯草芽孢桿菌可以高效利用秸稈水解液中的糖類物質，是一種可以工業生產乙偶姻的潛力菌株。

2.3 玉米秸稈水解殘渣造紙研究

玉米秸稈稀酸水解后的水解殘渣，經打漿、抄紙、壓榨、脫水、干燥處理后易于打漿，容易漂白。如圖6所示，紙張白度、勻度較好，紙漿得率較高，制成的紙張物理強度高，耐破度、耐折度良好，且外觀穩定，總體性能較好，適用于紙板的制造。

圖6 秸稈殘渣為原料造的紙Fig.6 Paper made from straw residues

3 結論與展望

目前，生物合成乙偶姻雖然在合成途徑工藝方面和工業應用等方面取得了一定成果，但想要讓生物合成法成為主要方法，很大程度上取決于底物的選用，目前生物轉化法所用的原料仍主要是葡萄糖，成本較高。葡萄糖、木糖和阿拉伯糖是木質纖維素生物質中含量最豐富的3種單糖，而玉米秸稈富含木質纖維素，所以玉米秸稈水解液則是一種經濟、高效的優質原料。通過優化得到最優水解條件為120 ℃，1.0%硫酸水解1 h，然后通過優化菌株選育、培養方案及發酵工藝，提高乙偶姻的產率，產量到達9.3 g/L，轉化率為0.44 g/g，水解殘渣經處理后還可以作為原料應用到造紙工業中，實現玉米秸稈的高效利用。未來，還需進一步增強對木質纖維素化學組成成分以及水解條件影響機制等理論體系的研究，針對性地剖析影響木質纖維素降解的反應機理，為繼續探尋新穎木質纖維素預處理技術提供信息支撐。