益生菌對(duì)H3N2流感病毒感染的特異性緩解作用

王倩雯，方志鋒，張?jiān)u滸，王鴻超，朱金林，趙建新,3，張灝,3，陳衛(wèi),3，陸文偉,3*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225009) 3(國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

流感病毒屬于正黏病毒，人流感病毒中的甲型流感曾多次引發(fā)世界性大流行。目前，H1N1和H3N2是全球常見(jiàn)的甲型流感病毒，仍然威脅著人類健康[1]。根據(jù)“肺-腸軸”理論，腸道菌群對(duì)維持呼吸道的健康具有重要的調(diào)節(jié)作用，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答以抵抗病毒感染。例如，腸道微生物的組分對(duì)維持正常的Toll樣受體先天信號(hào)至關(guān)重，腸內(nèi)啟動(dòng)的Toll樣受體信號(hào)可誘導(dǎo)肺部的免疫反應(yīng)，而腸道菌群常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)焦撬瑁龠M(jìn)造血作用刺激造血干細(xì)胞向抗炎環(huán)境分化，抗炎因子轉(zhuǎn)移到呼吸道后抑制呼吸道的炎癥反應(yīng)[2]。已有研究表明，益生菌可以通過(guò)多種作用機(jī)制以輔助機(jī)體抵抗病毒的侵染，包括提高機(jī)體非特異性和特異性免疫反應(yīng)[3]。宋翔等[4]驗(yàn)證了植物乳桿菌BLCC2-0125可同時(shí)增強(qiáng)黏膜免疫、細(xì)胞免疫及體液免疫，為機(jī)體在病毒感染早期提供保護(hù)。BOSCH等[5]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CECT7315/7316與流感疫苗聯(lián)用后，可增加流感特異性IgA和IgG。兩歧雙歧桿菌被證實(shí)具有調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫的作用，可以平衡Th1/Th2免疫應(yīng)答來(lái)抵抗流感病毒的感染[6]。本研究中，使用H3N2流感病毒侵染小鼠模型來(lái)探究益生菌對(duì)H3N2感染后機(jī)體免疫調(diào)控影響的異同以及其對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與病毒

實(shí)驗(yàn)使用的菌株BifidobacteriumbifidumFXJCJ9M10(B.bifidum1)，F(xiàn)SDJN705(B.bifidum2)，LactobacillusacidophilusJCM1132(L.acidophilus1)、FFJND6L5(L.acidophilus2)，BifidobacteriumbreeCCFM1025(B.bree1)、CCFM1026(B.bree2)均保藏于江南大學(xué)食品微生物保藏中心。所有菌株接種在mMRS(MRS培養(yǎng)基加入0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽)培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。使用梯度稀釋和平板計(jì)數(shù)的方法計(jì)算菌懸液的活菌數(shù)，確保每只小鼠灌胃的活菌數(shù)為2.5×108CFU/d。甲型流感病毒H3N2由禽流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、K2HPO4、乙醚、濃硫酸、無(wú)水硫酸鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EDTA-K2抗凝管，恒康醫(yī)療科技有限公司；利巴韋林，北京伊諾凱科技有限公司；增強(qiáng)型BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物(通用型，50×)、RIPA裂解液(強(qiáng)，無(wú)抑制劑)、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, H&E)染色液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；多聚甲醛，武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司；IL-6、IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒，南京森貝伽生物技術(shù)有限公司；糞便Fast DNA提取試劑盒，美國(guó)MP Biomedicals公司；TIANgel Mini Purification Kit PCR產(chǎn)物純化試劑盒，杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司；2×Taq master mix預(yù)混液，蘇州康為世紀(jì)生物科技有限公司。

ST3100 pH計(jì)，奧豪斯儀器有限公司；ME3002E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；MX-S渦旋混勻儀，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司；移液器，德國(guó)Eppendorf(艾本德)股份公司；DG250厭氧培養(yǎng)箱，英國(guó)Don Whitley Scientific 公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Micor21R高速冷凍離心機(jī)、Multiskan GO半自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BC-500自動(dòng)血液分析儀，深圳明瑞生物醫(yī)藥電子有限公司；C1000 Touch PCR熱循環(huán)儀，美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；MB100-2A微孔板恒溫振蕩器，杭州奧盛儀器有限公司；PANNORMIC MIDI數(shù)字切片掃描儀，匈牙利3DHistech有限公司；MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雌性ICR小鼠(3～4周齡)購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)操作均由動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.20210415)。小鼠被隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物陽(yáng)性參照奧司他韋組和6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(每組8只小鼠)，并進(jìn)行為期7 d的適應(yīng)。在病毒感染前兩周開(kāi)始每天用灌胃的方式對(duì)小鼠進(jìn)行菌懸液(實(shí)驗(yàn)組)或生理鹽水(空白組、模型組和藥物陽(yáng)性參照奧司他韋組)處理，持續(xù)到小鼠犧牲。干預(yù)兩周后，除空白組以外，所有組別的小鼠均采用鼻滴的方式感染H3N2病毒株，劑量為5倍50%致命劑量(5LD50)(圖1)。藥物陽(yáng)性參照組在48 h內(nèi)使用口服的奧司他韋治療。在病毒感染后，每天稱量小鼠體質(zhì)量直至犧牲。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸Fig.1 Time line of animal experiments

1.4 血常規(guī)檢查

部分血液樣本使用含有EDTA-K2抗凝管收集后，使用自動(dòng)血液學(xué)分析儀，進(jìn)行血細(xì)胞分析。剩余的血液離心后分離得到血清，保存在-80 ℃，用于后續(xù)細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.5 肺部損傷和病理分析

用0.8 mL無(wú)菌PBS進(jìn)行3次肺泡灌洗，部分肺泡灌洗液(bronchoaleolar laage fluid，BALF)保存在4 ℃用于乳酸脫氫酶活性檢測(cè)和總蛋白檢測(cè)，剩余BALF存放于-80 ℃用于后續(xù)細(xì)胞因子檢測(cè)。取左肺葉固定在福爾馬林中，然后使用石蠟包埋，切成5 μm厚度后進(jìn)行H&E染色。

1.6 細(xì)胞因子檢測(cè)

血清、BALF和肺組織勻漿上清中的細(xì)胞因子：IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、IFN-β、IFN-γ的表達(dá)水平利用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 腸道菌群

犧牲前收集小鼠的糞便，使用Fast DNA SPIN提取試劑盒提取糞便中的DNA。PCR擴(kuò)增3～4區(qū)域后，使用TIAN gel Mini Purification Kit 純化PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)濃度測(cè)定及文庫(kù)構(gòu)建后利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行16S測(cè)序[7]，然后分析腸道菌群多樣性的變化以及使用線性判別分析(liner discriminant analysis effect size，LEfSe)的方法比較不同組別腸道微生物群落之間的差異。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用單因子方差分析和Fisher’s LSD test進(jìn)行差異性分析。數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。P值<0.05認(rèn)為具有顯著性差異，與模型組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。 腸道微生物群的數(shù)據(jù)使用QIIME2 2019.7(https://iew.qiime2.org/)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生菌對(duì)H3N2感染小鼠體質(zhì)量減輕和肺部損傷的影響

在H3N2感染后，模型組小鼠的體質(zhì)量持續(xù)下降。益生菌和奧司他韋的治療在不同程度上緩解了體質(zhì)量下降的癥狀。其中，B.bifidum2的作用效果最好，L.acidophilus1和L.acidophilus2對(duì)體質(zhì)量下降的作用與奧司他韋相似(圖2-a)。BALF中乳酸脫氫酶活性是細(xì)胞毒性指標(biāo)，模型組小鼠在感染病毒后由于肺部出現(xiàn)損傷，導(dǎo)致BALF中乳酸脫氫酶活性與空白組相比顯著增加。

盡管部分益生菌干預(yù)有助于降低乳酸脫氫酶的活性，但與模型組無(wú)顯著性差異(圖2-b)。此外，病毒感染造成的肺部損傷會(huì)導(dǎo)致組織液外滲，增加BALF中蛋白質(zhì)含量。使用奧司他韋治療后，BALF中的蛋白質(zhì)的含量顯著降低，說(shuō)明肺部損傷得到有效緩解。B.bifidum2、B.bree1和B.bree2顯著降低了BALF中的蛋白質(zhì)含量，說(shuō)明這3株益生菌可顯著緩解小鼠的肺部損傷，其中，B.bifidum2效果優(yōu)于其他菌株(圖2-c)。

A-空白;B-模型;C-奧司他韋;D-B.bifidum 1;E-B.bifidum 2;F-L.acidophilus 1;G-L.acidophilus 2;H-B.bree 1;I-B.bree 2 a-H3N2病毒感染后5 d內(nèi)小鼠體質(zhì)量的變化率；b-小鼠BALF中乳酸脫氫酶活性；c-小鼠BALF中總蛋白含量圖2 益生菌對(duì)H3N2病毒感染后體質(zhì)量減輕和肺部損傷的影響Fig.2 Effects of probiotics on weight loss and lung damage after H3N2 irus infection

根據(jù)肺部病理切片可知，空白組小鼠肺部肺泡、氣管周和血管周均無(wú)明顯的炎癥細(xì)胞聚集(圖3-a)，H3N2感染后，肺泡、氣管周和血管周都出現(xiàn)了嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象(圖3-b)。B.bifidum2(圖3-e)、L.acidophilus2(圖3-g)和B.bree1(圖3-h)干預(yù)后，氣管周和血管周基本不見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭)，對(duì)肺部炎癥的緩解效果優(yōu)于同種菌的另一菌株。益生菌對(duì)H3N2流感病毒感染的緩解效果存在菌株差異，B.bifidum2的作用效果優(yōu)于其他益生菌。本研究的結(jié)果顯示，益生菌的干預(yù)在一定程度上可以緩解流感病毒H3N2給機(jī)體造成的損傷并存在菌株差異性，其中B.bifidum2的緩解效果最好。

2.2 不同益生菌對(duì)H3N2感染小鼠肺部免疫應(yīng)答的影響

與空白組相比，模型組小鼠感染H3N2病毒后，小鼠肺部的炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β顯著增加，而益生菌干預(yù)則有助于抑制炎癥因子的表達(dá)(圖4-b～圖4-d)。所有益生菌干預(yù)組中，肺部的IL-1β和TNF-α水平均顯著降低(圖4-c、圖4-d)。然而，只有B.bifidum2組中IL-1β和TNF-α水平與空白組相似，其他益生菌干預(yù)使得這2種炎癥因子水平低于空白組。另外，B.bifidum2和L.acidophilus2組小鼠肺部IFN-γ與模型組相比顯著降低，恢復(fù)至與空白相當(dāng)水平(圖4-b)。除了奧司他韋和B.bifidum1外，其余干預(yù)組均降低了肺部IL-6水平，B.bifidum2、B.bree1和B.bree2作用效果最顯著(圖4-a)。

a-空白組；b-模型組；c-藥物陽(yáng)性參照奧司他韋組；d-B.bifidum 1組； e-B.bifidum 2組；f-L.acidophilus 1組；g-L.acidophilus 2組； h-B.bree 1組；i-B.bree 2組圖3 益生菌對(duì)H3N2流感病毒感染后肺部病理的影響Fig.3 Effects of probiotics on lung pathology after H3N2 influenza irus infection

H3N2感染后，肺部的Ⅰ型干擾素IFN-β較空白組降低，而益生菌干預(yù)可以恢復(fù)肺部Ⅰ型干擾素的響應(yīng)，其中L.acidophilus2和B.bree1效果最顯著(圖4-e)。此外，B.bifidum2、L.acidophilus2和B.bree2顯著降低了小鼠肺部IL-10水平(圖4-f)。

綜上，本研究中益生菌菌株具有抑制肺部炎癥因子增加的作用，但不同益生菌的作用效果有顯著的區(qū)別。B.bifidum2有助于維持小鼠肺部先天免疫因子IL-1β和TNF-α的水平，盡管TNF-α和IL-1β通常被認(rèn)為是炎癥因子，但同時(shí)也是先天免疫抵抗病原體入侵的重要媒介，因此維持其正常水平對(duì)機(jī)體發(fā)揮先天免疫保護(hù)、抵抗病毒感染和減輕組織損傷非常關(guān)鍵[8-10]。

A-空白;B-模型;C-奧司他韋;D-B.bifidum 1;E-B.bifidum 2;F-L.acidophilus 1;G-L.acidophilus 2;H-B.bree 1;I-B.bree 2 a-BALF中IL-6水平；b-BALF中IFN-γ水平；c-肺組織勻漿中TNF-α水平；d-肺組織勻漿中IL-1β水平； e-BALF中IFN-β水平；f-BALF中IL-10水平圖4 益生菌對(duì)H3N2流感病毒感染后肺部免疫應(yīng)答細(xì)胞因子水平的影響Fig.4 Effect of probiotics on the leel of cytokines in lungs after H3N2 influenza irus infection

2.3 不同益生菌對(duì)H3N2感染小鼠系統(tǒng)免疫應(yīng)答的影響

與空白組相比，模型組在H3N2感染后血液中的淋巴細(xì)胞占比顯著降低(圖5-a)，而中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分比顯著增加(圖5-b、圖5-c)，說(shuō)明肺部感染引起了系統(tǒng)免疫響應(yīng)。奧司他韋治療后，淋巴細(xì)胞有明顯的恢復(fù)，使用B.bifidum1、B.bifidum2和B.bree2干預(yù)也具有恢復(fù)淋巴細(xì)胞水平的效果(圖5-a)。此外，B.bifidum的干預(yù)顯著降低中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的水平，B.bree降低中性粒細(xì)胞水平，其中B.bree1的干預(yù)部分恢復(fù)了血液中單核細(xì)胞的水平(圖5-b、圖5-c)。與前兩者相比，L.acidophilus對(duì)血細(xì)胞的影響較小。

H3N2感染后，小鼠血清中IL-6水平顯著增加，與上述系統(tǒng)免疫響應(yīng)的結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)組中，除了L.acidophilus2和B.bree1外，其他菌株均能顯著降低血清中IL-6水平，其中B.bifidum1和L.acidophilus1效果最顯著(圖5-d)。然而，H3N2感染卻顯著降低了血清中促炎因子IL-1β和TNF-α的水平(圖5-e、圖5-f)，可能抑制了小鼠先天性免疫的響應(yīng)[10]。在益生菌干預(yù)組中，除了B.bifidum1，益生菌干預(yù)都增加了小鼠血清中的TNF-α水平。其中，B.bifidum2血清中的TNF-α水平最高(圖5-e)。此外，B.bifidum2顯著恢復(fù)了血清中IL-1β水平(圖5-f)。結(jié)合肺部較高IL-1β和TNF-α表達(dá)水平，B.bifidum2可能激活了機(jī)體的先天免疫響應(yīng)以緩解H3N2感染。

模型組小鼠血清中IL-10水平相較于空白組沒(méi)有變化，而B(niǎo).bifidum1、B.bifidum2、L.acidophilus2和B.bree2均顯著增加了IL-10水平(圖5-g)。益生菌可以通過(guò)激活機(jī)體的免疫應(yīng)答以緩解H3N2感染，除了增強(qiáng)先天免疫應(yīng)答中促炎因子的響應(yīng)外，益生菌還增加抗炎因子IL-10的水平，維持免疫反應(yīng)的平衡，以減少抵抗病原體所引起的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成的損傷[11]。B.bifidum除了增加IL-10水平外，還增加了IFN-β在血清中的水平(圖5-h)，Ⅰ型干擾素響應(yīng)是機(jī)體抵抗病毒感染的重要途徑[12]。

2.4 不同益生菌對(duì)H3N2感染小鼠腸道菌群的影響

根據(jù)“肺-腸軸”理論，腸道微生物對(duì)維持呼吸道的健康起到關(guān)鍵作用[2]。α多樣性指數(shù)eenness和Shannon顯示，H3N2病毒感染后，腸道菌群的多樣性增加，說(shuō)明呼吸道病毒的感染影響了小鼠的腸道菌群。B.bifidum2和L.acidophilus2可以恢復(fù)α多樣性指數(shù)(圖6)。

A-空白;B-模型;C-奧司他韋;D-B.bifidum 1;E-B.bifidum 2;F-L.acidophilus 1;G-L.acidophilus 2;H-B.bree 1;I-B.bree 2 a-淋巴細(xì)胞占比；b-單核細(xì)胞占比；c-中性粒細(xì)胞占比；d-血清中IL-6水平；e-血清中TNF-α水平； f-血清中IL-1β水平；g-血清中IL-10水平；h-血清中IFN-β水平圖5 益生菌對(duì)H3N2流感病毒感染后血液中免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effects of probiotics on immuno cells and serum cytokines after H3N2 influenza irus infection

A-空白;B-模型;C-奧司他韋;D-B.bifidum 1;E-B.bifidum 2;F-L.acidophilus 1;G-L.acidophilus 2;H-B.bree 1;I-B.bree 2 a-eenness指數(shù)；b-Shannon指數(shù)圖6 益生菌對(duì)H3N2感染小鼠腸道菌群α多樣性的影響Fig.6 Effects of probiotics on α diersity in intestinal flora of H3N2 infected mice

利用LEfSe分析不同益生菌對(duì)腸道菌群組成的影響。與空白組相比，模型組小鼠腸道中Lachnospiraceae NK4A136 group，Ruminococcaceae UCG_014，Eubacteriumcoprostanoli和Roseburia等菌屬豐度顯著增加，Odoribacter和Jeotgalicoccus豐度減少(圖7-a)，與SENCIO等[13]研究的結(jié)果基本一致。毛螺菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)是短鏈脂肪酸的生產(chǎn)者[14]，流感病毒感染可能通過(guò)影響這類微生物的豐度來(lái)調(diào)節(jié)腸道中短鏈脂肪酸的水平。益生菌B.bifidum1，L.acidophilus2，B.bree1和B.bree2增加了腸道中Odoribacter的相對(duì)豐度。所有益生菌的干預(yù)都增加了Tyzzerella和CandidatusSaccharimonas，除了B.bifidum2和B.bree2組只增加了前者(圖7-b、圖7-c)。Tyzzerella，CandidatusSaccharimonas和Odoribacter被認(rèn)為與宿主免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[15-17]，因此，益生菌的通過(guò)增加腸道菌群中這些菌屬的豐度，達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的目的。

B.bifidum可以降低腸道中Eubacteriumcoprostanoligenesgroup和UBA 1819的相對(duì)豐度，其中B.bifidum2還降低了Lachnospiraceae NK4A136 group，一定程度上恢復(fù)了腸道菌群的平衡。此外，B.bifidum2特異地增加了腸道中的Allopreotella和Helicobacter，并減少了Akkermansia(圖7-b、圖7-c)。L.acidophilus也減少了Akkermansia豐度，其中L.acidophilus1特異地增加了Rikenella和Helicobacter。其中，Akkermansia在呼吸道病毒感染中起到的作用尚不明確[18-19]。益生菌的干預(yù)降低其豐度，可能減少了Akkermansia對(duì)H3N2感染帶來(lái)的負(fù)面影響。B.bifidum2和L.acidophilus1組中同時(shí)增加了Helicobacter豐度，被認(rèn)為能有效保護(hù)小鼠免受哮喘中組織炎癥的損傷，緩解炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管肺泡[20]。L.acidophilus2對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變較大，增加了Staphylococcus，Eubacteriumnodatumgroup，Corynebacterium1和Aerococcusspp.豐度(圖7-d、圖7-e)。B.bree1 和B.bree2則特異性地分別增加了Ruminococcaceae NK4A214 group和Dubosiella豐度(圖7-f、圖7-g)。綜上，益生菌對(duì)腸道菌群組成的調(diào)節(jié)同時(shí)存在共性和菌株特異性。其中，對(duì)H3N2緩解效果最好的B.bifidum2特異性地增加了Allopreotella相對(duì)豐度，Allopreotella有助于調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[21-22]，但其作用機(jī)制尚不清楚。

a-空白組與模型組LEfSe分析；b-B.bifidum 1組與模型組LEfSe分析；c-B.bifidum 2組與模型組LEfSe分析； d-L.acidophilus 1組與模型組LEfSe分析；e-L.acidophilus 2組與模型組LEfSe分析；f-B.bree 1組與模型組LEfSe分析； g-B.bree 2組與模型組LEfSe分析圖7 益生菌對(duì)H3N2流感病毒感染后小鼠腸道菌群組成的影響Fig.7 Probiotics affect the composition of gut flora in mice after H3N2 influenza irus infection

3 結(jié)論

綜上，不同益生菌對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用存在菌株特異性，可能與其對(duì)小鼠系統(tǒng)免疫的調(diào)節(jié)作用的相關(guān)，從而造成對(duì)H3N2感染不同的緩解效果。本研究發(fā)現(xiàn)了益生菌對(duì)腸道菌群組成和宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用均存在差異，而腸道微生態(tài)對(duì)免疫系統(tǒng)作用的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。