食醋酒精發酵階段非揮發性風味物質及微生物群落結構解析

劉海坡，闞濤，劉彩霞*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214000)2 (中國酒業協會，北京，100831) 3(江南大學(紹興)產業技術研究院，浙江 紹興，312000)

食醋是具有悠久釀造歷史的酸性調味品和保存劑，在人類生產生活中發揮非常重要的作用[1]。食醋釀造包括酒精發酵和醋酸發酵2個階段，具體釀造流程為：糯米→粉碎→蒸煮→糖化→酒精發酵→酒醅→拌麩皮、大糠→醋酸發酵→封醅→淋醋→煎醋→貯存→成品。酒精發酵階段將淀粉轉化為乙醇，發酵成為用于制作食醋的低度酒(制醋酒)，隨后制醋酒進入醋酸發酵階段，將乙醇轉化成醋酸最終成為食醋。

食醋酒精發酵階段包括淀粉質原料的糊化、糖化和酒化，與我國黃酒生產方式相似[2]，主要是通過糖化酶、淀粉酶以及酒化酶系共同催化完成。在醋酸發酵階段主要是通過醋酸菌、乳酸菌等微生物將乙醇氧化為醋酸，這些微生物除了產生乙酸還能產生大量的風味物質，賦予食醋豐富的口感和協調的香氣[3-4]。食醋酒精發酵作為食醋釀造的第一階段，對食醋質量具有重要影響，不僅為醋酸發酵提供前體乙醇，同時制醋酒中的氨基酸、有機酸及多種揮發性香氣物質也是食醋風味的來源。

目前，已有諸多學者對食醋醋酸發酵階段的風味及微生物群落結構動態變化進行研究[5-10]，然而對食醋酒精發酵階段的研究卻鮮有報道。本研究首次通過HPLC及三代測序技術對食醋酒精發酵階段的非揮發風味物質及微生物群落結構的動態變化進行詳細分析，揭示食醋酒精發酵階段釀造機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋發酵醪樣品和酒曲取自江蘇制醋工廠車間。分別取0、48、96、144 h的發酵醪樣品，設置3個平行，樣品于-80 ℃保存。

三氯乙酸、異丙醇、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)等試劑均為分析純，標準樣品均為色譜純。PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、DNA marker，寶生物工程(大連)有限公司；4S Green Plus 無毒核酸染料染色，上海生工；FastDigest Green Buffer 2×，Thermo Fisher公司；PCR產物純化試劑，杭州寶塞生物科技有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

PacBio RS II三代測序儀，美國太平洋生物科學公司；Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Thermo Fisher Trace氣相色譜質譜聯用儀，美國Thermo公司；5804R臺式高速大容量離心機，德國Eppendorf公司；164-5050電泳儀，北京六一儀器廠；Uniersal Hood Ⅱ凝膠成像系統，美國Bio-RAD公司。

1.3 實驗方法

樣品預處理：將取得的發酵醪液于10 000 r/min條件下離心10 min，取離心后上清液進行指標測定。

1.3.1 基本理化指標的測定

總酸、pH和酒精度檢測方法參照GB/T 13662—2018《黃酒》，還原糖濃度的測定采用DNS法[11]。

1.3.2 有機酸及氨基酸的測定

8種有機酸參照余寧華等[12]的方法進行測定，處理方法：0.75 mL上清液加入等體積三氯乙酸溶液(10%)，搖勻后于4 ℃靜置5 h，經10 000 r/min離心10 min，吸取上清液過0.22 μm濾膜，用于HPLC分析。17種游離氨基酸參照QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定 高效液相色譜法》進行測定。

1.3.3 微生物群落結構的測定

提取不同批次、不同時間點發酵醪和酒曲的基因組，并擴增分析，樣品信息如表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

提取發酵醪液與酒曲的基因組，提取方法參考文獻[13]。

擴增分析：基因組擴增參照文獻[14]，選擇細菌16S rDNA、真菌28S rDNA通用引物進行擴增。PCR產物純化后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至內蒙古農業大學測序。測序結果利用QIIME軟件[15]進行OTU分布統計、微生物群落、多樣性分析等統計學分析。

2 結果與分析

2.1 食醋酒精發酵階段基本理化指標測定

食醋酒精發酵階段采用先糖化后發酵工藝，先將液化酶、糖化酶作用于米粉，后接種酵母、酒曲進行發酵，形成用于制造食醋的低度酒(制醋酒)。本研究分析制醋酒理化指標變化，如圖1所示，發酵0 h時還原糖質量濃度為50.34 g/L，隨著發酵的進行，因微生物生長及產酒消耗還原糖呈現先急后緩的下降趨勢，在144 h降到2.50 g/L?？偹岷途凭瘸尸F上升趨勢，在144 h時總酸(以乙酸計)和酒精度分別達到4.71 g/L和8.43%ol，pH值在發酵過程中并未有明顯的變化。

圖1 食醋酒精發酵過程中理化指標的變化Fig.1 Changes of physicochemical indexes during inegar alcohol fermentation process

2.2 食醋酒精發酵階段有機酸與氨基酸的動態變化

在發酵過程中，制醋酒的有機酸質量濃度呈上升趨勢(圖2)，144 h時達到(20.96±0.31)g/L。經檢測得知，制醋酒中主要有機酸為乳酸和乙酸，與發酵黃酒一致[16]，其在發酵過程中呈增長趨勢，發酵144 h時分別達到(13.17±0.69)和(6.79±0.67)g/L，而其他有機酸質量濃度遠低于傳統發酵黃酒，這對制醋酒風味的豐富度具有一定影響。

圖2 食醋酒精發酵過程中有機酸質量濃度變化Fig.2 Changes of organic acid concentration during inegar alcohol fermentation process

制醋酒發酵過程中氨基酸質量濃度變化如圖3所示，共檢測了17種氨基酸，其中包括6種甜味氨基酸，8種苦味氨基酸，2種鮮味氨基酸以及1種澀味氨基酸，其中制醋酒中甜味跟苦味氨基酸濃度最高，分別占據氨基酸總量18.36%和68.89%，然而雖釀制工藝與黃酒相似，但制醋酒與發酵黃酒中甜味與苦味氨基酸占比(31.22%、48.06%)差異較大。同時氨基酸總量在發酵過程中呈現上升趨勢，到144 h時達到692.61 mg/L，但制醋酒中總氨基酸濃度遠低于發酵黃酒[17]。有研究發現氨基酸主要來源于原料中蛋白質分解和微生物的代謝[18]，食醋酒精發酵階段氨基酸分布占比和濃度受微生物代謝的影響，因此需進一步分析食醋酒精發酵階段微生群落結構。

圖3 食醋酒精發酵過程中氨基酸質量濃度變化Fig.3 Changes of amino acid concentration during inegar alcohol fermentation process

2.3 制醋酒發酵液及酒曲微生物群落結構的變化

2.3.1 發酵醪與酒曲中細菌群落結構分析

對采集自工廠的發酵醪液和酒曲樣品進行測序，經測序，樣品的Shannon指數隨著測序深度的增加趨于平坦，說明盡管隨著測序量的增加新的種系型可能會被發現，但是微生物的多樣性已經不再隨之發生變化，樣品測序數量達到了分析的要求，可進行后續分析。分析發酵過程中細菌群落結構，如圖4所示。

圖4 發酵醪液及酒曲中真菌群落結構組成(豐度1%以上)Fig.4 Bacteria community structure of fermentation mash and Jiuqu (abundance aboe 1%)

發酵144 h時，發酵醪中主要由戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus，28.60%)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，19.99%)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii，13.93%)以及解淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylolyticus，22.56%)組成，對比酒曲中細菌群落結構，其主要由地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis，84.16%)組成，與發酵醪液差異較大。在發酵過程中，戊糖乳桿菌(L.pentosus)和檸檬酸明串珠菌(Leuconostoccitreum)在發酵過程中呈下降趨勢，解淀粉乳酸桿菌(L.pentosus)、德氏乳桿菌(L.delbrueckii)呈上升趨勢，副干酪乳桿菌(L.paracasei)呈現先上升后下降的趨勢。發酵過程中，雖微生物分布占比略有差異，但發酵醪液中微生物均以戊糖乳桿菌(L.pentosus)、副干酪乳桿菌(L.paracasei)、檸檬酸明串珠菌(L.citrinum)、解淀粉乳酸桿菌(L.pentosus)和德氏乳桿菌(L.delbrueckii)為主導。

在發酵過程中形成了以乳酸菌為主導、群落結構簡單的微生物群系，這可能是造成制醋酒中乳酸濃度較高及風味單薄的原因之一。雖有文獻報道，明串珠菌具有一定的益生效果，能夠代謝產生雙乙酰、乙酸、乙醇等風味物質[19-20]，但食醋酒精發酵過程中明串珠菌相對豐度較低，對于風味的影響較小。同時酒曲中地衣芽孢桿菌(B.licheniformis，84.16%)相對豐度最高，有高分泌堿性蛋白酶的能力，是工業酶生產中最重要的細菌之一[21]，然而其卻未能成為黃酒發酵醪中的優勢物種，可能是由于地衣芽孢桿菌適宜于堿性環境下生長(pH 6.8～8.0)[22]，而食醋酒精發酵階段添加酒曲量較低且黃酒發酵醪的pH較低(3.17～3.27)，使得酒曲中的地衣芽孢桿菌未能在發酵醪中成為優勢菌種。雖芽孢桿菌未能在發酵醪液中成為優勢菌，但其可分泌蛋白酶、淀粉酶等，發揮液化和糖化作用，并且可通過三羧酸循環產生有機酸，有助于提升酒曲乃至食醋的品質[23-24]。

2.3.2 發酵醪及酒曲中真菌群落結構分析

發酵醪及酒曲中真菌群落結構如圖5所示，在種水平上，釀酒酵母(Saccharomycescereisiae)在發酵醪和酒曲中均占據絕對優勢。酒曲中釀酒酵母占比較高，相對豐度達到96.64%，可能與工廠制曲環境以及接觸器具有關。除釀酒酵母以外，酒曲中具有糖化、液化能力的曲霉、根霉屬占比較少，導致酒曲在發酵中起的糖化、液化作用十分有限，這也是工廠在食醋酒精發酵階段主要利用液化酶和糖化酶進行淀粉酶解的原因之一。同時在發酵醪中，釀酒酵母相對豐

圖5 發酵醪液及酒曲中真菌群落結構組成Fig.5 Fungal community structure of fermentation mash and Jiuqu

度也最高，達到99%以上，發酵醪中釀酒酵母占絕對優勢可能與食醋酒精發酵中利用酒曲以及純種黃酒活性干酵母接種有關。

根據微生物檢測結果可知，食醋酒精發酵過程中形成了以乳桿菌、明串珠菌和釀酒酵母為主導的微生物群系，這可影響發酵過程有機酸以及氨基酸的濃度與組成。有研究分析細菌、真菌與有機酸之間的關系發現，乳桿菌屬、明串珠菌屬是乳酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸等主要有機酸的主要貢獻者，且在真菌與有機酸模型的分析中發現，酵母菌屬與有機酸的形成存在一定的相關性[25]。同時有研究對3株釀酒酵母發酵過程中游離氨基酸變化進行分析，發現3株釀酒酵母發酵液中均含有17種游離氨基酸，但游離氨基酸組成和濃度存在明顯差異[26]，即釀酒酵母可產生氨基酸但不同的釀酒酵母產生的氨基酸的濃度與種類不同，這可能也是造成制醋酒中氨基酸濃度、組成與傳統黃酒差異較大的原因之一。同時也有研究通過宏基因組功能注釋發現，酵母屬涉及了葡萄糖降解、乳酸生成與代謝、乙酸生成、乙醇生成等的完整酶系、氨基酸、γ-氨基丁酸生成和降解、醇類、脂肪酸、酯類、酚類物質等物質代謝均于酵母屬相關[27]，即釀酒酵母在酒精發酵階段對于葡萄糖、酒精、氨基酸、有機酸的代謝具有重大作用。由此可知，食醋酒精發酵中以乳桿菌、明串珠菌和釀酒酵母為主導的微生物群系對發酵過程理化指標以及非揮發性風味物質有機酸、氨基酸的濃度以及組成具有十分重要的作用。

3 結論

本研究對酒精發酵階段制醋酒的理化指標及非揮發性風味物質進行分析，以研究酒精發酵階段釀造機理進一步指導生產。酒精發酵結束時(144 h)酒精度在7%～9%ol，總氨基酸質量濃度為692.61 mg/L，較傳統發酵黃酒低[16]，可能是由于酒精發酵階段采用的是黃酒的簡化工藝，米水比低、發酵時間短、酵母接種量低，導致微生物群落結構差異進而造成指標較低。

通過分析食醋酒精發酵醪液中微生物發現，其構成主要為解淀粉芽孢桿菌(L.amylolyticus)、德氏乳桿菌(L.delbrueckii)、副干酪乳桿菌(L.paracasei)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)、檸檬酸明串珠菌(L.citreum)及釀酒酵母(S.cereisiae)，相對豐度>1%的僅有6種，微生物群落結構簡單，且均有產酸特性，可大量產酸。同時酒曲中的細菌和真菌分別以地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)和釀酒酵母(S.cereisiae)為主，酒曲中具有糖化、液化作用的霉菌占比極低(1%以下)，其發揮的糖化、液化能力有限，這也是食醋酒精發酵過程中利用糖化、液化酶進行水解的原因之一。

本研究明確了食醋酒精發酵階段以乳酸菌、釀酒酵母為主導，他們對于有機酸、氨基酸的質量濃度和組成具有較大的影響。在本研究基礎上，可在食醋酒精發酵階段選用性能優良的酵母，以調整有機酸、氨基酸質量濃度達到產品香氣、口感的協調。同時研究發現，酒曲微生物結構簡單、糖化和液化能力相對較弱，由此，可從食醋制曲階段入手改良制曲工藝，豐富酒曲中微生物群落結構，增加酒曲液化、糖化力，使其逐漸取代酶制劑在食醋釀造中的使用。本研究分析食醋酒精發酵階段非揮發性風味物質變化，并利用三代測序技術分析微生物群落結構組成并探討其對于理化指標與非揮發性風味物質的影響，解析了食醋酒精發酵階段釀造機理，可為改進食醋發酵工藝和調控食醋產品品質提供支持。