一株來源于豆豉的地衣芽孢桿菌全基因組學及其風味物質形成分析

張盼文，李浩，徐鈺紅，楊慧林，王筱蘭

(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌，330022)

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，具有抗逆境能力強、抑制病原菌、產酶種類豐富等優良特性[1-2]，非常適用于食品發酵工業生產。在傳統食品曲霉型豆豉發酵過程中，地衣芽孢桿菌在大豆發酵過程中發揮著至關重要的作用，該菌具有良好的耐鹽性能[3]，發酵大豆的特征性芳香物質及關鍵的揮發性風味化合物和地衣芽孢桿菌息息相關[4]。這類菌可產生多種酶類分解生物大分子物質形成風味物質前體[5]，從而促進了豆豉風味物質的產生。其分泌的糖苷酶[6]主要降解豆豉中的纖維素等糖類物質生成葡萄糖以及代謝途徑中的其他小分子化合物，進而和氨基酸發生美拉德反應[7]，賦予豆豉獨特的香氣。

楊林子等[8]基于GC-MS探究了郫縣豆瓣醬中的地衣芽孢桿菌在化學體系中的酯合成途徑和能力；SHAH等[9]對海洋地衣芽孢桿菌生產更高纖維素酶的發酵條件進行了優化；KURIBAYASHI等[10]對來自地衣芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶在離子交換樹脂中的固定化進行研究，以利于生產低乳糖或無乳糖乳制品。上述研究表明地衣芽孢桿菌有豐富的酶類資源和良好的發酵潛能，其代謝潛力有待進一步研究。目前已有一些學者利用基因工程和頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法等技術探究及改善該菌的產酶及發酵性能[11]，但是從全基因組角度上對于該物種在大豆發酵過程中風味物質產生機理的相關研究未見報道。

本課題組先前研究發現，地衣芽孢桿菌存在于傳統豆豉發酵過程中的各個階段，并且在發酵中后期占據優勢地位[12]。豆豉發酵過程中，因為高溫和拌鹽的影響，葡萄球菌等大部分微生物含量都逐漸下降，而地衣芽孢桿菌的耐鹽和抗菌特性及其分泌蛋白酶和糖苷酶的能力對豆豉后發酵階段風味的產生仍有重要作用。因此，本研究利用全基因組測序技術獲取地衣芽孢桿菌JXNUWL7完整基因組序列，分析預測該菌株可能的功能基因和風味物質代謝機理，同時通過GC-MS技術對其純種發酵豆豉產生的揮發性物質進行測定分析，為地衣芽孢桿菌在豆制品發酵中的功能性作用及潛在應用價值方面的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

JXNUWL7菌株，江西省南昌市稻香園調味食品有限公司生產的曲霉型豆豉中分離篩選獲得；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、NaOH、HCl、NaCl(分析純)，西隴科學股份有限公司；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉，安琪酵母股份有限公司。

1.2 培養基

腦心浸液肉湯BHI Broth，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養基[13](g/L)：CMC-Na 10，蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，瓊脂20，pH (7.2±0.2)。

1.3 儀器與設備

HICO21臺式離心機，生工上海股份有限公司；PowerEase 90 W核酸凝膠電泳儀、HWS26電熱恒溫水浴鍋，上海申安器械廠；QL-901旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；T100型PCR儀，Bio-Rad公司；固相微萃取裝置(包括手柄和DB/CAR/PDMS萃取頭)，Supelco公司；7890A/5975氣相色譜-質譜聯用儀，Agilent公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 全基因組測序樣品制備

將實驗室低溫(-80 ℃)保藏的JXNUWL7菌株復蘇后接種于100 mL BHI液體種子培養基中，35 ℃、170 r/min培養24 h后，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液；參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書上的方法提取菌株的基因組。

1.4.2 全基因組測序和組裝

地衣芽孢桿菌JXNUWL7的基因組DNA經提取后通過Illumina HiSeq×10測序平臺完成全基因組測序，對符合要求的Clean data進行從頭組裝得到基因組序列，進行局部組裝和優化后利用短序列組裝軟件SOAPdenoo2進行拼接。

1.4.3 菌種種屬鑒定

僅通過16S rRNA基因序列分析的方法難以鑒別枯草芽孢桿菌菌群中的物種，編碼DNA回旋酶B亞單位蛋白的gyrB基因[14]被選中作為一種替代的系統發育標記用于物種鑒定。根據菌株JXNUWL7全基因組注釋結果，選取其中16S rRNA和gyrB基因序列提交至NCBI數據庫進行BLAST比對分析，利用MEGA 7.0.26軟件的鄰位連接法構建系統發育樹。

1.4.4 基因的預測與注釋

利用tRNAscan-SE 2.0、Barrnap、Glimmer軟件分別對該菌株基因組中包含的tRNA、rRNA和編碼序列(coding sequence, CDS)進行預測；將該菌株全基因組序列與6大數據庫(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)比對進行功能注釋，使用Diamond軟件比對eggNOG數據庫和KEGG數據庫對菌株進行COG和KEGG功能注釋，使用BLAST2 go軟件比對GO數據庫對菌株進行GO功能注釋。

1.4.5 CAZymes酶類注釋及驗證

利用Diamond、hmmscan軟件對菌株JXNUWL7的碳水化合物活性酶(carbohydrate-actie enzymes, CAZymes)進行預測。將活化的JXNUWL7菌株分別接入CMC-Na培養基中，在35 ℃恒溫培養箱中培養3 d。用0.2%剛果紅染色15 min，然后用1 mol/L NaCl溶液清洗2次后觀察是否產生透明圈。

1.4.6 次級代謝產物合成基因簇分析

通過antiSMASH軟件(http://antismash.secondarymetabolites.org)對樣本的次級代謝產物合成基因簇進行預測。

1.4.7 菌株培養及單菌發酵豆豉

將實驗室保藏的菌株JXNUWL7復蘇后轉接到100 mL液體種子培養基中，于37 ℃，170 r/min培養24 h，振蕩培養到菌懸液的OD600為0.8時停止培養。將培養好的菌懸液和滅菌(121 ℃，20 min)處理的黑豆按1∶10(mL∶g)在超凈工作臺內進行接種，均勻混合后覆上滅菌過的保鮮膜，在42 ℃發酵25 d。培養結束后，用GC-MS分別測定3組平行樣品揮發性風味物質。

1.4.8 風味化合物萃取

分別取發酵25 d的3組平行樣品進行研磨，過40目篩后稱取3 g樣品加到15 mL頂空進樣瓶中，60 ℃恒溫水浴平衡20 min，將SPME裝置置于進樣瓶上方，60 ℃萃取30 min，通過GC-MS進行分析。

1.4.9 GC-MS分析條件

色譜條件：Agilent 19091S-433毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1 mL/min，分流進樣；升溫程序：起始40 ℃，保持5 min，5 ℃/min升至60 ℃，10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

質譜條件：離子源EI，電離電壓70 e；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；MS1全掃描模式。

1.4.10 風味化合物的鑒定和含量計算

將各組分質譜信息與NIST17.L質譜庫對照，確定各組分成分。以質譜峰面積代表各組分含量，用峰面積歸一化法計算揮發性成分相對含量。

2 結果與分析

2.1 基因組概況及組分分析

對菌株JXNUWL7進行全基因組的測序，結果如表1所示，菌株全長為4 194 676 bp，GC含量為46.07%，包含45個重疊群(contigs)，長度>9 000 bp的重疊群有31個。基因元件預測結果顯示共有4 684個CDS，77個tRNA和8個rRNA，由基因長度分布圖(圖1)可得預測基因長度在150～299 bp的基因數量最多(667個，14.24%)。

表1 菌株JXNUWL7基因組組裝結果統計Table 1 Genome assembly results of strain JXNUWL7

圖1 菌株JXNUWL7編碼基因長度分布Fig.1 CDS length distribution of strain JXNUWL7

16S rRNA和gyrB基因構建系統發育樹結果顯示(圖2)，菌株JXNUWL7為地衣芽孢桿菌。將菌株JXNUWL7的全基因組序列提交至NCBI，獲得登錄號為：JAJAU000000000。

a-基于16S rRNA序列；b-基于gyrB序列圖2 菌株JXNUWL7的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain JXNUWL7

2.2 基因功能注釋

2.2.1 基礎注釋

通過比對EggNOG數據庫中的信息對菌株JXNU7基因組進行COG注釋結果表明，共有3 379個CDS具有COG功能注釋結果(圖3)，占基因總數的72.14%。其中碳水化合物代謝和氨基酸代謝是主要代謝過程，相關CDS分別為309個(9.14%)和300個(8.88%)，主要的COG功能分別注釋為磷酸轉移酶系統(phosphotransferase system, PTS)組成成分和ABC轉運蛋白。ABC轉運蛋白參與物質運輸，維持細胞滲透壓平衡，可能和該菌的耐鹽能力相關[15]。

GO注釋結果(圖4)顯示有3 197個CDS注釋歸到3大類43個條目中，在生物學過程分類中，參與氧化還原過程和轉錄調控的CDS最多，分別為310個(6.62%)和265個(8.29%)；在細胞成分分類中，膜的組成部分注釋到的CDS數量最多，為1 024個(32.03%)；在分子功能分類中，注釋到與ATP結合和DNA結合功能相關的CDS最多，分別為355個(11.10%)和307個(9.60%)。

A-RA加工和修飾；B-染色質結構和動力學；C-能源生產和轉化；D-細胞周期控制、細胞分裂、染色體分裂；E-氨基酸轉運和代謝；F-核苷酸轉運和代謝；G-碳水化合物運輸和代謝；H-輔酶運輸和代謝；I-脂質運輸和代謝；J-翻譯、核糖體結構和生物發生；K-轉錄；L-復制、重組和修復；M-細胞壁/膜/包膜生物發生；N-細胞運動；O-翻譯后修飾、蛋白質周轉、伴侶；P-無機離子轉運和代謝；Q-次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝；R-僅一般功能預測；S-功能未知；T-信號轉導機制；U-細胞內運輸、分泌和囊泡 運輸；-防御機制；W-細胞外結構；Y-核結構；Z-細胞骨架圖3 GOG注釋分類統計Fig.3 COG annotation classification statistics chart

KEGG通路注釋結果顯示(圖5)，共2 276個基因注釋到6個信號通路層次202條通路中。在代謝層次，與碳水化合物代謝(290個)和氨基酸代謝(209個)相關的基因占比最多。此外，KEGG共注釋到了41個PTS系統，其中和纖維素代謝相關的PTS系統數最多(18個)。

圖4 GO注釋分類統計Fig.4 GO annotation classification statistics chart

如圖6所示，JXNUWL7基因組中包含15條碳水化合物代謝通路信息，且淀粉和蔗糖代謝的基因數量最多(59個)。碳代謝注釋結果表明菌株JXNUWL7可能代謝多種糖類，其中間產物將進入其他代謝通路進一步參與揮發性風味物質和功能性物質的合成。此外，地衣芽孢桿菌JXNUWL7含有129個與雙組分系統相關的基因和128個ABC轉運蛋白相關的基因，這些系統對于細菌感應環境刺激和適應環境脅迫有重要作用[16-17]。

圖5 菌株JXNUWL7的KEGG注釋通路分類統計Fig.5 Classification statistics of KEGG annotation pathway about strain JXNUWL7

圖6 JXNUXL7碳水化合物代謝通路統計圖Fig.6 Statistical diagram of JXNUXL7 carbohydrate metabolism metabolic pathways

2.2.2 碳水化合物活性酶CAZy注釋

將基因組序列與CAZy數據庫進行比對，發現菌株JXNUWL7的基因組中共有116個基因編碼的蛋白質結構域屬于CAZy家族，包括30類糖苷水解酶家族(glycoside hydrolases, GHs)48個、10類糖苷轉移酶家族(glycosyl transferases, GTs)34個、7類碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases, CEs)14個、11類碳水化合物結合組件(carbohydrate-binding modules, CBMs)12個和7類多糖裂解酶(polysaccharide lyases, PLs)8個。其中注釋為GT2、GT4、GT51、GH1、GH4、CE4和CE12的基因序列數量相對較多。研究表明，24%的原核生物中存在編碼含有纖維素酶的GH家族的基因[18]，其中GH1和GH3家族的基因編碼β-葡萄糖苷酶，而其他GH家族存在編碼內切和外切葡聚糖酶的基因。本研究在KEGG通路中，該菌株注釋到的β-葡萄糖苷酶bglB和bglX分別屬于GH1和GH3家族，它們在纖維素降解中有重要作用。

2.2.3 纖維素代謝

KEGG通路注釋結果分析表明，共有290個基因和碳水化合物代謝相關，其中內切葡聚糖酶(EC:3.2.1.4)和葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.20、EC:3.2.1.21)參與纖維素降解。為進一步確定菌株JXNUWL7是否可以降解纖維素，通過纖維素培養基結合剛果紅染色法進行驗證，結果表明該菌株能降解纖維素(圖7)。通過KEGG注釋結果分析菌株JXNUWL7的纖維素降解代謝相關基因并繪制出其主要的代謝通路(圖8)，對通路進行分析可知菌株JXNUWL7可以降解纖維素，并通過糖酵解和三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環代謝生成的各類中間產物進一步參與氨基酸代謝和脂質代謝生成其他風味和功能性物質。根據對KEGG通路注釋結果中風味物質合成相關途徑分析的結果表明，該菌株可能通過莽草酸途徑生成各類芳香族化合物，也可能通過丁酸代謝生成乙偶姻和丁二醇。與此同時，對脂肪酸代謝通路進行分析發現，該菌株因缺少關鍵酶CPT1的編碼基因而無法代謝棕櫚酰輔酶A，但包含從乙酰輔酶A合成不飽和酰基-[acp]的途徑。這說明該菌株雖然對豆豉中粗脂肪的降解貢獻不大，但可能代謝生成中長鏈風味物質，胡會萍等[19]所報道的和本研究一致。

圖7 JXNUXL7 對纖維素的利用Fig.7 Utilization of JXNUXL7 for cellulose

CelC-PTS系統，特定于纖維二糖的ⅡA組件；CelF-6-磷酸-β-葡萄糖苷酶；Pgm-磷酸葡萄糖變位酶；GalU-UTP-葡萄糖-l-磷酸尿苷基轉移酶；BglB/X-β-葡萄糖苷酶；AroH-分支酸變位酶；EntC-異分支酸合酶；EntB-雙功能異分支酸裂解酶；EntA-2,3-二氫-2，3-二羥基苯甲酸脫氫酶；DhbE-2,3-二羥基苯甲酸酯-AMP連接酶；DhbB-芳基載體蛋白；DhbF-非核糖體肽合成酶；TrpE-鄰氨基苯甲酸合酶組分Ⅰ；BioF-8-氨基-7-氧雜壬酸合酶；BioA-賴氨酸-8-氨基-7-氧雜壬酸氨基轉移酶；BioD-脫硫生物素合成酶；BioB-生物素合酶；IlB-乙酰 乳酸合酶Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ大亞基；AlsD-乙酰乳酸脫羧酶；ButA-丁二醇脫氫酶；Ldh-L-乳酸脫氫酶圖8 JXNUXL7纖維素代謝通路和相關風味及功能性物質形成通路Fig.8 Cellulose metabolism pathway and the related flaors and functional substances formation pathways in JXNUXL7

2.3 次級代謝產物合成基因簇分析

利用antismash軟件對樣本的次級代謝產物合成基因簇進行預測分析，一共有9個次級代謝產物合成基因簇，具體的預測分析結果見表2。將菌株JXNUWL7所有基因簇與已知的次級代謝產物基因簇做BLAST比對后發現，有4個功能已知的合成基因簇和5個功能未知的合成基因簇，這說明菌株JXNUWL7基因組序列中可能存在新的活性物質合成基因簇。羊毛硫抗生素是一類作用于革蘭氏陽性菌細胞膜上的熱穩定抗菌肽[20]，可以作為抗菌藥物的替代品，地衣芽孢桿菌JXNUWL7基因組中羊毛硫抗菌肽基因簇(圖9)與抗生素基因簇K21 A1/K21 A2(lichenicidin K21 A1/K21 A2)相似性達到100%，可能作為羊毛硫抗生素合成開發的目標菌種。該菌種含有由13個基因組成的鐵載體基因簇，這些基因和芽孢桿菌類微生物的耐鹽性能有關[21]。

表2 JXNUWL7次級代謝產物合成基因簇預測分析結果Table 2 Prediction and analysis results of secondary metabolite synthesis gene cluster of JXNUWL7

圖9 羊毛硫肽合成基因簇線性圖譜Fig.9 Linear map of lantipeptide synthesis gene cluster 注：圖譜展示預測基因簇中所有的基因，其中不同注釋基因的顏色采用該基因在COG分類中的顏色的進行顯示，不同顏色 代表的功能詳見COG分析界面，灰色代表該基因沒有注釋到COG

2.4 揮發性風味物質測定

對該菌株發酵大豆的揮發性風味物質進行GC-MS測定，主要揮發性風味物質及相對含量見電子增強出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.030716)，地衣芽孢桿菌JXNUWL7發酵黑豆樣品中共鑒定出86種香氣成分，主要包含9種酯類、6種醛類、15種酮類、7種吡嗪類。以往研究表明，地衣芽孢桿菌在大曲中主要產生吡嗪類、丁酸和丁酮類風味物質[22]，但本研究中地衣芽孢桿菌發酵豆豉還可以產生大量芳香酯和苯乙酮類等對甜香和果香有重要貢獻的揮發性風味物質，這可能是由于豆豉發酵環境中富含蛋白質。本研究對地衣芽孢桿菌JXNUWL7純種發酵豆豉進行GC-MS分析結果表明，相對蒸煮黑豆的揮發性風味物質成分[23-24]而言，純種發酵黑豆吡嗪類、芳香酯類、苯乙酮、長鏈酮類和丁酸類物質增加，而正己醇和甲基麥芽酚含量大幅下降，且苯甲醛含量幾乎不變，這說明黑豆中的正己醇和甲基麥芽酚可能被地衣芽孢桿菌代謝利用。

3 結論

本研究探討了菌株JXNUWL7基因組中可能涉及的糖苷酶種類，地衣芽孢桿菌JXNUWL7可能產生包括β-葡萄糖苷酶在內的66種碳水化合物活性酶，并含有豐富的纖維素代謝相關的磷酸轉移酶系統，具備完整的纖維素降解通路，這對于降解纖維素等糖苷類物質生成相應的單糖，進而通過糖酵解和三羧酸循環等途徑生成乙醇、乳酸、二磷酸尿苷葡萄糖等小分子物質作為風味物質和功能性物質前體具有重要作用，從而促進風味物質的產生。同時，通過GC-MS和全基因組測序對地衣芽孢桿菌JXNUWL7單菌發酵大豆的揮發性風味物質進行測定和分析，揭示出該菌株主要對豆豉芳香類、吡嗪類和中長鏈酮類風味物質有重要貢獻，同時，解析出該菌株含有分支酸、乙偶姻、中長鏈?；?[acp]等與風味物質合成相關的代謝途徑。從基因層次上解讀了該菌株在豆豉發酵過程中的耐鹽和抗菌能力的原因。本研究通過全基因組學分析和GC-MS技術對地衣芽孢桿菌潛在的功能性基因進行挖掘以及揮發性風味物質形成進行分析，為研究曲霉型豆豉發酵過程中功能微生物的代謝機理奠定了基礎。