硅納米粒子吸附交聯(lián)固定化蔗糖異構(gòu)酶的制備及其酶學(xué)性能研究

陳寧，常保根，施念，路福平，劉夫鋒

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室， 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

異麥芽酮糖(isomaltulose)，又稱(chēng)帕拉金糖，是一種功能性二糖。異麥芽酮糖作為蔗糖的同分異構(gòu)體，與蔗糖有著相似的口感和物理性質(zhì)。與蔗糖相比，異麥芽酮糖具有良好的酸穩(wěn)定性、極低的吸濕性和較高的安全性，在食品中具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景[1-3]。作為新型的甜味劑，異麥芽酮糖還具有甜度低(約為蔗糖甜度的50%)、易于吸收、非致齲齒性和低熱量等優(yōu)點(diǎn)，非常適合肥胖患者、糖尿病人和體育運(yùn)動(dòng)員等食用[4-5]。此外，本身為還原糖的異麥芽酮糖還可作為前體生產(chǎn)新型功能性食用糖醇[6]。鑒于其優(yōu)良的特性，異麥芽酮糖也受到越來(lái)越多人的關(guān)注。

目前，異麥芽酮糖主要是利用蔗糖異構(gòu)酶(sucrose isomerase, SIase, EC 5.4.99.11)異構(gòu)催化蔗糖生成，催化作用如圖1所示。然而，游離SIase在工業(yè)生產(chǎn)中存在產(chǎn)物的純化分離難度大，不可回收再利用等缺點(diǎn)，酶固定化成為解決上述問(wèn)題的手段之一。近年來(lái)，關(guān)于SIase固定化的研究已有少量報(bào)道。CONTESINI等[7]利用微膠囊包埋法和硅藻土吸附法將來(lái)源于Erwiniasp.的SIase進(jìn)行固定化，所得2種固定化酶的酶活力回收率和操作穩(wěn)定性均較差；為了提高固定化后的酶活力，WU等[8-9]采用ε-poly-L-lysine修飾的介孔TiO2和海綿作為載體固定化SIase，所得固定化酶的酶活力回收率分別為84.5%和93.2%；在此基礎(chǔ)上，孟虹等[10]又制備了SIase-Cu2+納米花固定化酶，在4 ℃保存15 d后仍能保留80%的初始活性，且循環(huán)使用6次后，仍剩余40%酶活性。表明固定化明顯提高了SIase的操作穩(wěn)定性和酶活力回收率，且固定化材料較為新穎，但由于生產(chǎn)成本較高，限制了工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。因此，尋求成本經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單、酶活力回收率高且操作穩(wěn)定性良好的SIase固定化方法受到越來(lái)越多的關(guān)注。

吸附固定化與交聯(lián)固定化是酶固定化的常用方法。然而，單純物理吸附所得固定化酶穩(wěn)定性較差，酶易泄露，且隨機(jī)的物理吸附無(wú)法控制載體表面酶的密度，易形成多層吸附繼而對(duì)酶的催化活性造成不利影響[11]；而直接通過(guò)交聯(lián)得到的酶聚集體，大小無(wú)法控制，對(duì)于較大的交聯(lián)聚集體，大量的酶被包裹在聚集體內(nèi)部，不易與底物接觸，造成酶催化活性降低，且聚集體的機(jī)械性能較差，實(shí)際應(yīng)用受到限制[12]。因此在實(shí)際生產(chǎn)中常常將這2種方法結(jié)合使用，吸附-交聯(lián)固定化可將酶的回收與固定化同時(shí)進(jìn)行，適用于發(fā)酵液中酶的固定化，不僅提高了酶的構(gòu)象穩(wěn)定性和固定化酶的機(jī)械性能，還具有成本低廉、制備過(guò)程簡(jiǎn)單、酶結(jié)合牢固、適用于非特異性載體等優(yōu)點(diǎn)。硅納米粒子(silica nanoparticle, SNP)具有機(jī)械強(qiáng)度高、化學(xué)/熱穩(wěn)定性好、成本低、易獲得、不與酶反應(yīng)、比表面積大等特性，在酶的固定化領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13-14]。

圖1 蔗糖異構(gòu)酶的水解作用和異構(gòu)化作用的反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Reaction mechanism of SIase-catalyzed hydrolysis and isomerization

本研究擬利用吸附-交聯(lián)法對(duì)SIase進(jìn)行固定化。首先采用硅納米粒子為載體對(duì)SIase進(jìn)行吸附，后用戊二醛(glutaraldehyde,GA)對(duì)吸附在硅納米粒子周?chē)拿高M(jìn)行交聯(lián)，優(yōu)化蔗糖異構(gòu)酶吸附-交聯(lián)固定化條件，并對(duì)固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)(催化活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性和操作穩(wěn)定性)進(jìn)行探討，以期得到高效的SIase固定化酶，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

材料和試劑：硅納米粒子(500 nm，實(shí)心球體)，Aladdin；戊二醛(250 g/L)、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4，上海麥克林生化科技有限公司；蔗糖，上海源葉生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、YNB培養(yǎng)基、甘油、瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；甲醇、生物素， 賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6D電泳儀，北京市六一儀器廠；HZS-H水浴恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子有限公司；Mettler-Toledo電子天平，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；Centrifuge 5418小型高速離心機(jī)、Heto Drywinner冷凍干燥機(jī)、MaxQ6000恒溫調(diào)速搖床、Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；WP25AB臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蔗糖異構(gòu)酶的制備

取適量保存于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱的畢赤酵母，采用三區(qū)劃線(xiàn)法接種于YPD固體培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉)上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d，獲得單菌落。將單菌落接種至5 mL的YPD液體培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中，30 ℃、220 r/min恒溫培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移至250 mL的BMGY培養(yǎng)基[1%酵母粉、2%蛋白胨、2%甘油、0.2%生物素、25 mL 10×YNB、磷酸鹽緩沖液(1 mol/L，pH 6.0)]中傳代培養(yǎng)16 h(30 ℃、220 r/min)；3 000 r/min條件下離心5 min收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基[1%酵母粉、2%蛋白胨、0.2%的生物素、25 mL 10×YNB、磷酸鹽緩沖液(1 mol/L，pH 6.0)]清洗菌體2遍以除去甘油等物質(zhì)。最后將菌體重懸于250 mL BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每天早晚各加入0.5%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)5 d后，將發(fā)酵液于3 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，所得上清液即為SIase粗酶液，保存于4 ℃?zhèn)溆谩＠檬榛蛩徕c-聚丙烯酰氨凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)測(cè)定SIase的純度。

1.3.2 酶活力測(cè)定

將400 μL含有蔗糖(250 g/L)的磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L，pH 6.0)和100 μL適當(dāng)稀釋的酶溶液在2 mL的EP管中充分混合，置于35 ℃水浴中反應(yīng)10 min，后煮沸5 min以終止反應(yīng)。利用3,5-二硝基水楊酸比色法(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)測(cè)定生成還原糖的量。1個(gè)酶活力單位是指1 min內(nèi)催化蔗糖異構(gòu)產(chǎn)生1 μmol異麥芽酮糖所需的酶量。固定化酶活力回收率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.3 蔗糖異構(gòu)酶的固定化

稱(chēng)取25 mg硅球，加入4 mL含一定酶活力的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 6.0)，于4 ℃振蕩吸附一段時(shí)間，得到硅球吸附固定化酶(S-CLEAs)；后加入適量戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，在4 ℃條件下振蕩交聯(lián)一段時(shí)間，離心收集固定化酶，用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)洗滌以除去未交聯(lián)的游離酶和戊二醛，得到硅球吸附交聯(lián)固定化酶(S-CLEAs-GA)。

以固定化酶活力回收率為指標(biāo)，分別研究酶添加量(5.2、6.9、8.6、10.4、12.1 U/mL)、吸附時(shí)間(2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)、交聯(lián)時(shí)間(1、2、3、4、5 h)和戊二醛添加量(0.5、0.6、0.8、0.9、1.0 g/L)對(duì)固定化效果的影響。

1.3.4 固定化酶的穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.4.1 溫度對(duì)酶活性的影響

為考察溫度對(duì)SIase固定化前后酶活性的影響，測(cè)定了各種酶制劑在不同溫度下處理后的剩余酶活力。用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)配制等濃度的游離和固定化酶溶液，并將各種酶制劑分別置于不同溫度(25～55 ℃)的恒溫水浴中處理30 min后，按照1.3.2中的酶活性測(cè)定方法，以蔗糖為底物在25 ℃條件下測(cè)定各酶制劑的剩余活性。

1.3.4.2 pH對(duì)酶活性的影響

為考察pH對(duì)SIase固定化前后酶活力的影響，測(cè)定了這種酶制劑在不同pH下處理后的剩余酶活力。具體如下：以不同pH的緩沖液[磷酸氫二鈉-檸檬酸鈉(pH 4.0、5.0),磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉(pH 6.0、7.0)和Tris-HCl(pH 8.0、9.0)]為溶劑，分別配制相同濃度的游離和固定化酶溶液，并將其置于25 ℃水浴搖床中處理2 h；按照1.3.2中的酶活性測(cè)定方法，以蔗糖為底物在25 ℃條件下測(cè)定各種酶制劑的剩余活性。

1.3.4.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性

取一定量的S-CLEAs和S-CLEAs-GA，配制成相同濃度的固定化酶溶液，在最適反應(yīng)條件下以蔗糖為底物測(cè)定其活性。將反應(yīng)溶液離心分離去上清液，用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L, pH 6.0)反復(fù)洗滌，以除去未反應(yīng)的底物和產(chǎn)物；隨后將離心洗滌后的固定化酶重新分散于緩沖液中，加入新的底物進(jìn)行下一次的反應(yīng)，如此重復(fù)15次。連續(xù)測(cè)定固定化酶在循環(huán)多次后的剩余酶活力，將第一次使用時(shí)的酶活力定義為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 SIase游離酶的制備

發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳分析如圖2所示，在分子質(zhì)量約為65 kDa處觀察到明顯的目的條帶，說(shuō)明發(fā)酵上清液中主要含有SIase。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1-SIase發(fā)酵上清液圖2 蔗糖異構(gòu)酶的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of sucrose isomerase

2.2 固定化酶的制備與優(yōu)化

在硅球質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL、4 ℃條件下，吸附足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以考察不同酶加量對(duì)固定化酶活力回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)酶加量為8.6 U/mL時(shí)，酶活力回收率達(dá)到最大，為51.7%。但繼續(xù)提高酶加量，酶活力回收率卻明顯下降，這可能是由于大量酶沉淀在硅球表面導(dǎo)致聚集，即SIase在載體上形成多層吸附，導(dǎo)致了空間位阻效應(yīng)，限制了底物的傳質(zhì)，從而催化活性降低[11]。因此，選取初始酶加量為8.6 U/mL。

圖3 酶加量對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on actiity recoery of immobilized enzyme

在硅球質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL、加酶量為8.6 U/mL、4 ℃的條件下，研究了吸附時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶的酶活力回收率先增加后降低，在吸附時(shí)間為5 h時(shí)，載體和酶的作用達(dá)到飽和，酶活力回收率達(dá)到最大值，為51.5%。當(dāng)吸附時(shí)間大于5 h，酶活力回收率下降明顯，這可能是由于酶自身穩(wěn)定性的限制，酶失活的幾率隨吸附時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。因此確定吸附時(shí)間為5 h，且此時(shí)所得的硅球吸附固定化酶命名為S-CLEAs。

圖4 吸附時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.4 Effect of adsorption time on actiity recoery of immobilized enzyme

在硅球質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL、加酶量為8.6 U/mL、吸附時(shí)間為5 h、4 ℃的條件下，研究了戊二醛添加量對(duì)固定化酶活力回收率的影響(圖5)。戊二醛是酶固定化制備過(guò)程中最常用的交聯(lián)劑。從圖5可以看出，固定化酶活力回收率隨著戊二醛添加量的增加先增大后減小，主要是因?yàn)槲於┘瓤勺鳛榻宦?lián)劑又是酶的變性劑[15]。當(dāng)加入少量戊二醛時(shí)，酶因?yàn)樵诠枨虮砻娌怀浞值慕宦?lián)而導(dǎo)致酶活力回收率較低，且在使用過(guò)程中酶易脫落，損失較多；繼續(xù)提高戊二醛添加量后，酶活力回收率下降，這是由于過(guò)量的戊二醛造成了酶分子之間的過(guò)度交聯(lián)，且將過(guò)多的酶交聯(lián)在一起，影響了酶蛋白的活性[12]；當(dāng)戊二醛添加量為0.08%時(shí)，S-CLEAs-GA的酶活力回收率最高，達(dá)到44.9%。因此，S-CLEAs-GA的最適戊二醛添加量為0.08%。

圖5 戊二醛添加量對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.5 Effect of glutaraldehyde concentration on actiity recoery of immobilized enzyme

在硅球質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL、加酶量為8.6 U/mL、吸附時(shí)間為5 h、戊二醛添加量為0.08%、4 ℃的條件下，研究了交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為2 h時(shí)，酶活力回收率達(dá)到最高值，為44.2%。繼續(xù)延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，酶活力回收率下降趨勢(shì)明顯。這可能是由于過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的交聯(lián)，導(dǎo)致形成的固定化酶的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)太過(guò)緊密，使S-CLEAs-GA空間位阻變大，阻礙了酶與底物的接觸，造成酶活力的下降[16]。因此，制備S-CLEAs-GA的最佳交聯(lián)時(shí)間是2 h。

圖6 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.6 Effect of cross-linking time on actiity recoery of immobilized enzyme

采用吸附法和吸附-交聯(lián)法對(duì)SIase進(jìn)行固定化，并對(duì)其固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最優(yōu)的固定化條件為：加酶量為8.6 U/mL，吸附時(shí)間為5 h，戊二醛添加量為0.08%，交聯(lián)時(shí)間為2 h。得到2種固定化酶，硅球吸附固定化酶(S-CLEAs)和硅球吸附-交聯(lián)固定化酶(S-CLEAs-GA)，酶活力回收率分別為51.2%和44.9%。

2.3 固定化酶的酶學(xué)特性

溫度對(duì)游離酶和固定化酶活性的影響見(jiàn)圖7。隨著溫度的上升，游離酶和固定化酶的活性也隨之降低，且當(dāng)處理溫度較高時(shí)，酶制劑活性急劇下降，這可能是由于高溫引起的酶的變性所致[17]；但固定化酶在實(shí)驗(yàn)測(cè)定所有溫度下均表現(xiàn)出較高的抗熱應(yīng)力穩(wěn)定性。

圖7 溫度對(duì)游離SIase和固定化酶活性的影響Fig.7 Effect of temperature on the actiities of free SIase and immobilized enzyme

為了進(jìn)一步研究固定化酶在極端pH條件下的耐受性，將各種酶樣品置于不同pH緩沖溶液中處理并測(cè)定其剩余活性，結(jié)果如圖8所示。可以看出，游離SIase受環(huán)境酸堿度變化的影響更大，且在酸性環(huán)境中活性下降的更為明顯。在相同處理?xiàng)l件下，固定化酶的耐受性提高，尤其是在酸性環(huán)境中，說(shuō)明SIase的固定化有利于穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)[18]。

圖8 pH對(duì)游離SIase和固定化酶活性的影響Fig.8 Effect of pH on the actiities of free SIase and immobilized enzyme

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與游離酶相比，固定化酶表現(xiàn)出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。將SIase通過(guò)非共價(jià)鍵吸附固定在硅球表面(S-CLEAs)，由于不涉及共價(jià)鍵的形成，很大程度地保留了酶分子結(jié)構(gòu)的完整性，減少了因構(gòu)象變化造成的活性損失[19-20]。而S-CLEAs-GA主要是酶分子間通過(guò)交聯(lián)劑多點(diǎn)共價(jià)連接在硅球的周?chē)@樣可增強(qiáng)酶的剛性、提高構(gòu)象穩(wěn)定性、防止酶的構(gòu)象轉(zhuǎn)變并保護(hù)酶結(jié)構(gòu)不被破壞，增強(qiáng)了酶抵抗外界條件的能力[21-22]。但由于交聯(lián)對(duì)酶分子構(gòu)象的影響較大，與S-CLEAs(51.2%)相比，S-CLEAs-GA的酶活力回收率比較低(44.9%)。

2.4 固定化酶的操作穩(wěn)定性

固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性對(duì)其工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。以蔗糖為底物，分別考察了S-CLEAs和S-CLEAs-GA在連續(xù)使用15次后酶活力回收率的變化，結(jié)果見(jiàn)圖9。可以看出，隨著循環(huán)使用次數(shù)的增加，2種固定化酶的酶活力回收率都有所降低。循環(huán)使用15次后，S-CLEAs和S-CLEAs-GA的酶活力回收率分別為55.1%和77.9%。表明S-CLEAs-GA的操作穩(wěn)定性明顯優(yōu)于S-CLEAs，主要是由于S-CLEAs在連續(xù)振蕩、回收、洗滌、重復(fù)使用等頻繁處理過(guò)程中，吸附在載體表面的酶脫落，引起整個(gè)反應(yīng)體系中酶活力的降低[23]。而經(jīng)戊二醛交聯(lián)所得的S-CLEAs-GA面對(duì)這些操作時(shí)，可以很好地將酶保留在載體的表面。此外，在重復(fù)使用過(guò)程中酶的變性也是固定化酶活力損失的一個(gè)重要原因[24]。THMTURK等[25]將聚乙烯亞胺包裹在SNP表面，并以此為載體通過(guò)靜電吸附固定化乙酰膽堿酯酶，所得固定化酶的酶活力回收率為91%，但在重復(fù)使用12次后，其相對(duì)活性就降到50%以下；隨后，NGUYEN等[26]用活性炭顆粒吸附漆酶后所得固定化酶循環(huán)使用12次后，可保留初始活性的71%；本實(shí)驗(yàn)室前期制備的交聯(lián)磷脂酶D聚集體，在最適條件下的酶活力回收率高達(dá)118.8%，但重復(fù)使用10次后，僅保留50.4%的初始活性[27]。這些結(jié)果都說(shuō)明吸附-交聯(lián)固定化所得的S-CLEAs-GA不僅具有較高的催化活性，且優(yōu)異的操作穩(wěn)定性使其在實(shí)際生產(chǎn)中具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

圖9 固定化酶S-CLEAs和S-CLEAs-GA的重復(fù)使用性Fig.9 Reusability of S-CLEAs and S-CLEAs-GA

3 結(jié)論

本文以硅納米粒子為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，利用吸附法和吸附-交聯(lián)法固定化蔗糖異構(gòu)酶，得到S-CLEAs和S-CLEAs-GA兩種固定化酶。在酶加量為8.6 U/mL、吸附時(shí)間為5 h時(shí)，S-CLEAs的最大酶活力回收率為51.2%；隨后加入0.08%的戊二醛、交聯(lián)2 h后，得到的S-CLEAs-GA的最大酶活力回收率為44.9%。固定化酶表現(xiàn)出優(yōu)異的的熱穩(wěn)定性和pH耐受性，且S-CLEAs-GA的穩(wěn)定性?xún)?yōu)于S-CLEAs。在重復(fù)使用15次后，S-CLEAs和S-CLEAs-GA仍然能夠保持55%以上的初始酶活力。表明此方法得到的固定化酶擁有良好的酶活力回收率和操作穩(wěn)定性，其性能遠(yuǎn)優(yōu)于游離酶，具有良好的發(fā)展前景。