響應(yīng)面法優(yōu)化糯玉米淀粉酶解工藝制備抗消化淀粉

孫琳琳 ，李克文 ，孫桂蓮 ， 龔魁杰 ，， 劉開昌 ，

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100；2. 保齡寶生物股份有限公司，山東 禹城 251200）

糯玉米，也稱蠟質(zhì)玉米，在我國(guó)廣泛種植[1]。糯玉米中淀粉含量為65%～75%，糯玉米淀粉基本上是由支鏈淀粉組成[2]，與普通玉米淀粉相比，易糊化、膨脹力高、黏滯性大和透明度高，經(jīng)常在釀酒、制藥、食品添加劑及飼料等方面有很好的應(yīng)用[3-5]。糯玉米淀粉經(jīng)改性后，其開發(fā)利用前景更為廣泛。

根據(jù)淀粉消化特點(diǎn)將淀粉分為快速消化淀粉、慢消化淀粉和抗性淀粉[6]?？焖傧矸凼侵冈谛∧c內(nèi)被迅速消化吸收的淀粉；慢消化淀粉指小腸內(nèi)被完全消化吸收，但吸收速度較慢的淀粉[7]；抗性淀粉指不能被小腸的淀粉酶消化吸收的淀粉[8]，其主要在大腸中發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，RS3 是膳食中抗性淀粉的重要成分[9-10]?？剐缘矸酆吐矸劬邆錉I(yíng)養(yǎng)與功能的雙特性，對(duì)糖尿病和肥胖癥等慢性疾病有一定的預(yù)防和控制作用[11-13]。

采用酶法制備慢消化淀粉和抗性淀粉，無(wú)化學(xué)殘留、安全，符合食品發(fā)展的趨勢(shì)。糯玉米淀粉高度分支，用于制備慢消化淀粉和抗性淀粉具有比普通玉米淀粉更高的制備效率。淀粉酶是一種脫支酶，對(duì)α-1,6- 糖苷鍵水解具有很強(qiáng)的專一性[14]。試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)考查不同因素對(duì)SDS 和RS 含量的影響，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝，為異淀粉酶對(duì)糯玉米淀粉SDS 和RS 的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糯玉米淀粉，市售；豬胰α - 淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶，Sigma 公司提供；醋酸鈉、DNS、無(wú)水乙醇等，均為分析純?cè)噭?/p>

KjeitecTM 8400 型凱式定氮儀，丹麥FOSS 公司產(chǎn)品；GL124-1SCN 型分析天平，德國(guó)賽多利斯有限公司產(chǎn)品；PKDD-5 型大容量離心機(jī)，湖南平科儀器有限公司產(chǎn)品；GZX-9240MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；UV-2600型紫外- 可見分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；FE28-bio pH 計(jì)，瑞士梅特勒- 托利多有限公司產(chǎn)品；JYL-Y92 型粉碎機(jī)，山東九陽(yáng)電器有限公司產(chǎn)品；DK-98-ⅡA 型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外消化性測(cè)定方法

參考文獻(xiàn)[15-16]中的方法稍作修改，稱取1 g 淀粉樣品（干基），將其溶于0.1 mol/L 的醋酸鈉緩沖液（pH 值5.2） 20 mL 中，在漩渦混勻器上劇烈混勻，加7 粒玻璃珠振蕩水浴5 min，加入5 mL 混酶液（豬胰α - 淀粉酶活性為290 U/mL，淀粉葡萄糖苷酶15 U/mL）。將此混合溶液在37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩水浴。在20，120 min 時(shí)取樣0.5 mL，加入20 mL的無(wú)水乙醇離心管中滅酶，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min。采用DNS 法測(cè)定葡萄糖含量。

20 min 測(cè)定獲得葡萄糖含量為快速消化淀粉（RDS），20～120 min 測(cè)定獲得葡萄糖含量為慢消化淀粉（SDS），120 min 時(shí)仍未消化的淀粉為抗性淀粉（RS）。

1.2.2 糯玉米淀粉酶解工藝

參考文獻(xiàn)[17-18]方法稍作修改，取適量糯玉米淀粉配制成20%淀粉乳，微波使淀粉完全糊化，然后冷卻至酶解溫度，添加適量異淀粉酶在最適pH 值5.8 條件下酶解脫支處理一定時(shí)間，酶解結(jié)束后，馬上將溶液加熱到100 ℃保持15 min 滅酶。之后用冰浴迅速冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH 值至中性，離心取上清，最后在4 ℃條件下冷藏老化一定時(shí)間，然后置于鼓風(fēng)干燥箱中45 ℃下烘干，粉碎，測(cè)定SDS+RS的含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酶解時(shí)間（15，30，60，90，120 min）、酶添加量 （1，3，5，7，9 U/g）、酶解溫度 （40，45，50，55，60 ℃）、老化時(shí)間 （12，24，48，72，96 h） 為影響因素，分別考查各因素對(duì)SDS+RS 含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

運(yùn)用Design Expert 8.0.6.1 軟件，采用響應(yīng)曲面法，以SDS+RS 含量為指標(biāo)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合建立回歸模型。

因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)SDS+RS 含量的影響

酶解時(shí)間對(duì)SDS+RS 含量的影響見圖1。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)SDS+RS 含量的影響

由圖1 可看出，隨著酶解時(shí)間的增加，SDS+RS含量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間為60 min時(shí)，SDS+RS 含量達(dá)到最高為29.373%±0.141%。酶解時(shí)間在15～60 min 時(shí)，SDS+RS 含量增加較快，酶解時(shí)間超過(guò)60 min 時(shí)，SDS+RS 含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，可能是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，異淀粉酶會(huì)把糯玉米淀粉分解為小分子糖類，使直鏈淀粉含量下降，不利于老化，使得SDS+RS 含量下降。因此，酶解時(shí)間選擇60 min 為最佳。

2.1.2 酶添加量對(duì)SDS+RS 含量的影響

酶添加量對(duì)SDS+RS 含量的影響見圖2。

圖2 酶添加量對(duì)SDS+RS 含量的影響

由圖2 可看出，隨著酶添加量的增加，SDS+RS含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，酶添加量由1 U/g 增加到3 U/g，SDS+RS 含量急速上升為27.267%±0.316%，而隨著酶量的繼續(xù)增加，SDS+RS 含量卻出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，這可能是過(guò)多的異淀粉酶進(jìn)一步酶解直鏈淀粉為麥芽糖和麥芽二糖[19]，過(guò)短直鏈淀粉對(duì)SDS+RS 的形成重組有消極影響。因此酶添加量選擇3 U/g 為最佳。

2.1.3 酶解溫度對(duì)SDS+RS 含量的影響

酶解溫度對(duì)SDS+RS 含量的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)SDS+RS 含量的影響

由圖3 可看出，糯玉米SDS+RS 制備過(guò)程中SDS+RS 含量隨酶解溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，酶解溫度為50 ℃時(shí)，SDS+RS 含量最高為28.330%±0.353%。這可能是與異淀粉酶活性受溫度影響有關(guān)，溫度太高會(huì)抑制異淀粉酶活性[20]。因此，酶解溫度選擇50 ℃為最佳。

2.1.4 老化時(shí)間對(duì)SDS+RS 含量的影響

老化時(shí)間對(duì)SDS+RS 含量的影響見圖4。

圖4 老化時(shí)間對(duì)SDS+RS 含量的影響

由圖4 可看出，SDS+RS 含量的變化隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，老化時(shí)間48～96 h下降趨勢(shì)較為平緩，由27.267%±0.316%下降到26.175%±0.200%，因此老化時(shí)間選擇24 h 為最佳。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 模型建立與分析

為確定糯玉米淀粉酶解的最優(yōu)工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以SDS+RS 含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。

Box-behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 軟件，通過(guò)表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸模型為：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

對(duì)SDS+RS 方差分析結(jié)果表明，所建立的二次回歸模型是極顯著的（p＜0.01），失擬項(xiàng)差異不顯著，p=0.146 2＞0.05，說(shuō)明試驗(yàn)的二次多項(xiàng)式回歸無(wú)失擬性因素存在，回歸模型與試驗(yàn)值結(jié)果擬合較好，具有代表性。回歸方程中一次項(xiàng)A、B 表現(xiàn)極為顯著，一次項(xiàng)C 表現(xiàn)為顯著，而二次項(xiàng)BD 表現(xiàn)為顯著，二次項(xiàng)CD、A2、B2、C2、D2表現(xiàn)為極顯著，說(shuō)明這些因素對(duì)響應(yīng)值的影響較大，且各因素之間非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。同時(shí)，回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.968 9 和R2Adj=0.937 9，說(shuō)明可以利用該回歸方程對(duì)酶解工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)回歸模型方程中各因素回歸系數(shù)絕對(duì)值大小，可知各因素影響SDS+RS 含量的順序?yàn)槊柑砑恿浚˙） ＞酶解時(shí)間（A） ＞老化時(shí)間（C） ＞ 酶解溫度 （D）。

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

各因素交互作用對(duì)SDS+RS 含量影響的響應(yīng)曲面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)SDS+RS 含量影響的響應(yīng)曲面圖

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面，考查擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析4 個(gè)因素對(duì)SDS+RS 含量的影響。通過(guò)Design Expert 軟件分析，得出糯玉米淀粉酶解最佳工藝條件為酶解時(shí)間48.88 min，酶添加量2.69 U/g，老化時(shí)間23.78 h，酶解溫度49.62 ℃，此時(shí)SDS+RS含量預(yù)測(cè)值為34.200 6%?？紤]到實(shí)際操作情況，將條件修正為酶解時(shí)間49 min，酶添加量2.7 U/g，老化時(shí)間23.8 h，酶解溫度49 ℃，在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到SDS+RS 含量為34.103%，與模型預(yù)測(cè)值較為接近。采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶解工藝條件比較可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)研究酶解時(shí)間、酶添加量、老化時(shí)間、酶解溫度對(duì)糯玉米淀粉酶解提高SDS 和RS 含量的影響，采用異淀粉酶對(duì)糯玉米淀粉進(jìn)行酶解，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)酶解糯玉米淀粉工藝進(jìn)行優(yōu)化。最佳工藝條件為酶解時(shí)間49 min，酶添加量2.7 U/g，老化時(shí)間23.8 h，酶解溫度49 ℃，在此優(yōu)化條件下酶解糯玉米淀粉得到SDS+RS 含量為34.103%。在后續(xù)研究中可對(duì)酶解液進(jìn)行純化以提高SDS 和RS含量。