藍莓花色苷抑菌活性及其在復合果蔬肉制品中的應用

路高勇，馬 劍，陳智玲，邊道剛，馬艷弘

（1. 豐縣綜合檢驗檢測中心，江蘇 徐州 221700；2. 江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3. 徐州雙信食品有限公司，江蘇 徐州 221700）

即食果蔬肉制品是在傳統即食肉制品基礎上，加入水果、蔬菜、大豆蛋白和調味料等輔料煮制而成的熟食復合肉制品。因其營養全面、風味獨特、方便快捷等優點備受市場青睞[1]。隨著人們對食品安全與營養健康認知的提高，復合果蔬肉制品的綠色制造及其品質提升技術已經成為肉制品加工領域的研究熱點。但是，復合果蔬肉制品的貨架期短，在生產和銷售過程中極易被微生物污染而成為人類食源性疾病的載體[2-3]。因此，復合果蔬肉制品的貯藏保鮮技術是復合肉制品工業化生產中亟待解決的技術問題。

藍莓是21 世紀功能性保健漿果，被聯合國糧農組織（FAO） 列為人類五大健康食品之一[4]，具有極高的經濟價值和開發前景。藍莓含有多種活性物質，如花色苷、黃酮醇、酚酸等[5]，具有免疫調節、保護視力[6]、抗炎抗腫瘤、抗氧化[7]、抗衰老[8]、保護心血管[9]等多種藥理保健功能，在功能食品、生物醫藥、醫療美容等領域均具有良好的發展潛力。其中，藍莓花色苷作為一種天然色素，被認為是最有效的天然自由基清除劑[10]。有研究表明，藍莓花色苷對枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等致病菌具有一定的抑制作用[11]。但迄今為止，藍莓花色苷在肉制品防腐保鮮方面的研究報道較為少見。因此，以藍莓渣為原料提取花色苷，通過研究其抑菌作用及其對復合果蔬肉制品的保鮮效果，旨在為天然植物保鮮劑的開發和藍莓渣的高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓渣，句容萬山紅遍生物科技有限公司提供；供試菌株：大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌，江蘇省農業科學院農產品加工研究所提供；鮮豬肉、山藥、蘋果及調味料，購自蘇果超市；雞蛋皮、紅薯泥、蘋果汁、大豆蛋白，徐州雙信食品有限公司提供；BCA 蛋白測試盒，丙二醛（MDA） 試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、瓊脂，國藥集團化學試劑有限公司提供；其他試劑均為國產分析純級。

1.2 儀器與設備

HPP600 MPa 型超高壓食品處理裝置，包頭科發高壓科技有限責任公司產品；RE-5220 型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；HJ-6A 型多頭磁力攪拌器，常州國華儀器有限公司產品；ZD-F12 型真空冷凍干燥機，南京載智自動化設備有限公司產品；LRH-150 型生化培養箱，上海一恒科技有限公司產品；HH-2 型恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器廠產品；Epoch 型全自動酶標儀，BioTek 公司產品；D-B5 型紫外可見分光光度計，上海奧析科學儀器有限公司產品；SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；3K15 臺式冷凍離心機，德國Sigma 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓花色苷的制備

參照李鵬等人[12]研究方法稍做修改，取藍莓渣干粉按1∶20（g∶mL） 的料液比加入60%乙醇溶液（V/V，pH 值3.0），轉入聚乙烯袋，封口后置于超高壓設備中于400 MPa 壓力下保壓9 min，然后離心，上清液通過旋轉蒸發儀濃縮，再用AB-8 型大孔樹脂純化，50%乙醇溶液洗脫2 次，合并洗脫液，旋轉蒸發儀濃縮，真空冷凍干燥至恒質量得藍莓花色苷，于-20 ℃下冷凍保藏備用。

1.3.2 藍莓花色苷體外抑菌活性

（1） 菌種活化及菌懸液的制備。取出保存的大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌菌懸液于常溫下解凍，取100 μL 大腸桿菌和沙門氏菌菌懸液加入到100 mL LB 液體培養基中，100 μL 單增李斯特菌菌懸液加入到100 mL BHI 液體培養基中，均在溫度37 ℃，轉速 120 r/min 搖床培養 18～24 h，活化 2 次后置于4 ℃冰箱中待用。在超凈臺中，用無菌生理鹽水稀釋活化好的菌種，制備濃度為106～108CFU/mL的菌懸液，備用。

（2） 抑菌活性的測定。參照李曉嬌等人[13]研究方法稍做修改。分別配置質量濃度為0，2.5，5.0，10.0 mg/mL 的藍莓渣花色苷溶液。將活化的供試菌種100 μL 接種到100 mL 固體培養基中，搖勻，倒平板，待完全凝固后，用滅過菌的打孔器打出4 個直徑約為10 mm 的孔，吸取200 μL 花色苷溶液加入到孔中，無菌生理鹽水作為空白對照，放置于37 ℃生化培養箱中培養24 h。觀察是否出現抑菌圈，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑大小，并作記錄。

（3） 最小抑菌（MIC） 濃度的測定。采用二倍稀釋法[14]，分別配制30 mL 終質量濃度為10.000，5.000，2.500，1.250，0.625，0.313 mg/mL 藍莓渣花色苷培養基，無菌水作為空白對照。將培養基倒入平皿中，待冷卻凝固后，將50 μL 菌懸液加入平皿中并涂布均勻。將供試菌置于培養箱中37℃下培養24 h，觀察有無可見菌落并計數。

1.3.3 果蔬重組肉制品的制備

（1） 工藝流程。原料肉混合→絞碎→混合拌料（加紅薯泥、蘋果汁、香菇丁、大豆蛋白、香辛料）→腌制→成型→蒸煮→冷卻→藍莓花色苷溶液浸漬→真空包裝→冷藏。

（2） 操作要點。①原料肉去除筋膜，將2 份前腿肉，1 份五花肉混合絞碎，再加0.5 份紅薯泥和0.6 份蘋果汁，0.1 份香菇丁，0.05 份大豆蛋白、香辛料充分混勻，腌制40 min，裝入模具壓制成型，蒸煮熟化20 min，冷卻后放入藍莓花色苷溶液中浸漬1 min（溶液中花色苷添加量占復合肉制品的質量濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0 mg/g），瀝去水分，真空包裝，于4 ℃下冷藏備用。②添加的香辛料（占復合肉制品的質量百分比）：食鹽1.5%，桂皮0.1%，八角0.1%，花椒0.15%，生姜0.35%，大蔥0.5%，醬油0.2%，白酒1%。

1.3.4 感官評價

將制備好的復合肉制品切片，選擇10 名受過專業訓練成員組成的感官評價小組，在標準品嘗室進行感官評價。

產品感官質量評分標準見表1。

表1 產品感官質量評分標準

1.3.5 花色苷對復合果蔬肉制品的防腐保鮮效果分析

以未用花色苷處理的樣品作對照，每隔2 d 取樣測定復合果蔬肉制品的TVB-N（揮發性氨基氮）、脂質氧化（丙二醛） 值、細菌總數等指標。

菌落總數的測定：根據GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗菌落總數測定》[15]，采用傾注平皿計數法測定樣品菌落總數變化。評價標準：熟肉制品中微生物安全限量標準為5 lgCFU/g[16]。

揮發性鹽基氮（TVB-N） 值的測定：根據GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[17]。即取5 g 均質樣品，加入25.0 mL三氯乙酸溶液振搖1 min，靜置15 min 待蛋白沉淀后過濾，采用凱氏定氮儀進行蒸餾，5 mL 硼酸加2 滴指示劑用于接收蒸餾液，最后以鹽酸標準滴定溶液（0.010 mol/L） 滴定至終點。

脂質氧化（丙二醛） 值的測定：采用硫代巴比妥酸法測定脂質氧化程度[18]。結果以丙二醛（MDA）表示。準確稱取樣品2.0 g，加入8 mL 生理鹽水，冰水浴條件下超聲破碎2 min 制成樣品懸液，檢測MDA 含量。具體按照細胞丙二醛（MDA） 測試試劑盒說明書進行測定。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3 次，結果取平均值。采用Origin 8.5.0 進行繪圖和數據分析。

2 結果與分析

2.1 藍莓花色苷的抑菌能力分析

2.1.1 藍莓渣花色苷的抑菌能力

藍莓渣花色苷的抑菌效果見圖1，藍莓渣花色苷的抑菌能力見表2。

圖1 藍莓渣花色苷的抑菌效果

由圖1 和表2 可知，與對照組相比，加入藍莓渣花色苷的小孔均出現明顯的抑菌圈，表明藍莓渣花色苷對3 種供試菌均具有抑菌效果[11]，且抑菌圈直徑隨著藍莓渣花色苷質量濃度的增加而增大。藍莓渣花色苷對3 種致病菌的抑菌作用強弱的依次為沙門氏菌＞大腸桿菌＞單增李斯特菌。當花色苷質量濃度為10 mg/mL 時，沙門氏菌出現的抑菌圈最大，直徑達到20.07±1.10 mm，而大腸桿菌和單增李斯特菌的抑菌圈直徑分別為19.93±1.90，17.47±1.50 mm。說明，藍莓花色苷中的錦葵色素和矢車菊素對3 種食品中常見的致病菌有著良好的抑制作用，通過改變菌體的細胞膜通透性達到抑菌的效果。

表2 藍莓渣花色苷的抑菌能力

2.1.2 最小抑菌質量濃度（MIC） 的測定

藍莓渣花色苷的最小抑菌質量濃度見表3。

表3 藍莓渣花色苷的最小抑菌質量濃度

由表3 可知，與對照組相比，藍莓渣花色苷對3 種致病菌的生長均具有一定的抑制作用，且抑制能力隨著花色苷質量濃度的增大而增大。對于不同菌種，花色苷的抑制效果不同，對大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的最小抑菌質量濃度分別為5，10，5 mg/mL，表明藍莓花色苷對大腸桿菌和沙門氏菌有較強的抑菌作用，而對單增李斯特菌的抑制效果相對較弱。藍莓花色苷對于食品中常見的有害菌都存在一定的一致作用，對于藍莓花色苷在復合果蔬肉質品種的應用提供一定的理論基礎，具有廣闊的開發前景。

2.2 藍莓花色苷對復合果蔬肉制品感官評分的影響

復合果蔬肉制品感官評定結果見圖2。

圖2 復合果蔬肉制品感官評定結果

由圖2 可知，除0.5 mg/g 花色苷處理組外，其他花色苷處理組的感官評分均顯著高于對照組（p＜0.05），其中高含量2.0 mg/g 花色苷處理組的感官評分最高（93.3±3.67），但其與4.0 mg/g 花色苷處理組 （91.42±2.87） 無顯著性差異 （p＞0.05），高含量的花色苷處理后，復合果蔬肉制品的色澤變得更加具有特點，口感風味更加突出，營養品質保存較好，導致其感官評分較高；1.0 mg/g 處理組感官評價略低，可能是此時花色苷含量對樣品的口感影響較小，主要為色澤的改變，導致其感官得分的上升，表明一定含量的藍莓渣花色苷能有效提高復合果蔬肉制品的色澤和風味。

2.3 藍莓花色苷對復合果蔬肉制品脂質抗氧化程度的影響

丙二醛是評判肉類中脂肪氧化的良好指標，由動物脂質代謝轉化而生成[18]。

復合果蔬肉制品冷藏過程中的MDA 值見圖3。

圖3 復合果蔬肉制品冷藏過程中的MDA 值

由圖3 可知，各組復合肉制品的MDA 含量隨貯藏期的延長而迅速增加，說明樣品中均發生了脂質氧化反應。復合肉制品的各組冷藏前4 d，MDA 上升速度緩慢，4 d 之后，各組MDA 含量快速升高。且在相同冷藏時間內，花色苷濃度越大，復合肉制品中MDA 含量越低，冷藏到第10 天時，對照組MDA 含量 （6.57 nmol/mg pro）t 上升至初始值 （3.12 nmol/mg pro）t 的2 倍，說明脂質氧化是肉制品貯藏過程中最易發生的反應，也是復合果蔬肉制品品質下降的重要原因；而4.0 mg/g 花色苷處理組MDA 含量為4.87 nmol/mg prot，比對照組降低了25.88%，說明添加外源花色苷可以很好地抑制復合果蔬肉制品中脂質反應的發生，這是由于花色苷中具有很強的羥基清除能力和抗氧化能力。因此，藍莓花色苷在防止復合果蔬肉制品脂質氧化方面作用突出，表現出極強的保鮮能力。

2.4 藍莓花色苷對復合肉制品TVB-N 的影響

揮發性鹽基氮是肉制品蛋白質在微生物或內源蛋白酶共同作用下生成的含氮降解產物，通常被作為評判肉制品新鮮程度的重要指標[19]。

復合果蔬肉制品冷藏過程中TVB-N 值見圖4。

圖4 復合果蔬肉制品冷藏過程中TVB-N 值

由圖4 可知，2 d 之內，各組揮發性鹽基氮含量相對平緩，2 d 之后，隨著貯藏期的延長，各組復合果蔬肉制品的揮發性鹽基氮含量均呈上升趨勢，其中空白組的上升速度最快，說明其新鮮度最差[19]。同一貯藏期內，花色苷濃度越高，其復合果蔬肉質品的TVB-N 的含量越低，表明花色苷能抑制樣品中微生物的產生，從而降低復合果蔬肉質品的TVB-N 值。在第6 天時，對照組的TVB-N 值達21.9 mg/100 g，已超過了國家規定的變質肉標準（20 mg/100 g）。而4 mg/g 處理組在貯藏的第10 天時其揮發性鹽基氮值為17.12 mg/100 g，比對照組降低了39.58%，并低于國家標準，表明用4 mg/g 處理后的復合果蔬肉制品保留新鮮程度較長，并且具有食用價值。由此可知，添加藍莓花色苷可有效延緩復合果蔬肉制品的腐敗程度，降低TVB-N 值的含量，從而延長保藏時間，達到保鮮目的。

2.5 藍莓花色苷對貯藏期復合肉制品菌落總數的影響

微生物是導致肉制品腐敗的重要因素，降低微生物含量是延長肉制品貯藏期的重要技術手段。

復合肉制品冷藏過程中菌落總數的變化見表4。

表4 復合肉制品冷藏過程中菌落總數的變化

由表4 可知，隨著冷藏時間的延長，各組復合肉制品中菌落總數都有所增加。同一時間內，花色苷處理組菌落總數低于對照組，高含量花色苷處理組菌落總數少于低含量花色苷處理組。貯藏到第8 天時，對照組與0.5 mg/g 處理組的菌落總數均超過國家標準最低要求，而其他花色苷處理組的菌落總數均低于國家標準最低要求。其中4.0 mg/g 花色苷處理組在貯藏10 d 時仍具有食用價值，其菌落總數為4.732±0.059 lg（CFU/g），顯著低于其他處理組（p＜0.05）。其中，比對照組的菌落總數降低了31.33%，表明較高含量的藍莓渣花色苷能抑制細菌的增殖，對復合肉制品具有一定的防腐保鮮作用。

3 結論

藍莓花色苷色澤誘人、食用安全性高，且具有較高的抗氧化活性和抑菌能力，在食品、藥品和化妝品等領域具有較高的應用價值和市場開發潛力。研究考查了藍莓花色苷對大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的抑菌效果。結果表明，藍莓花色苷對3 種菌均有抑菌作用，強弱順序為沙門氏菌＞大腸桿菌＞單增李斯特菌，當花色苷質量濃度為10 mg/mL 時，直徑分別達到 20.07±1.10，19.93±1.90，17.47±1.50 mm，最小抑菌質量濃度（MIC） 分別為5，5，10 mg/mL。進一步將藍莓花色苷應用于果蔬復合肉制品的保鮮，探討其對產品冷藏過程中品質變化的影響。結果表明，2.0～4.0 mg/g 花色苷處理的復合果蔬肉制品色澤紅潤、香氣濃郁、口感細膩有嚼勁，感官評分較高。藍莓花色苷能有效降低復合肉制品的脂肪和蛋白質氧化程度，抑制細菌生長。當貯藏10 d 時，與對照組相比，4.0 mg/g 花色苷處理組的MDA 含量 （4.87 nmol/mg pro）t 降低了25.88%，揮發性鹽基氮值降低了39.58%，菌落總數降低了31.33%，仍具有食用價值。說明藍莓花色苷不僅能有效改善復合果蔬肉制品的色澤和風味，還能顯著抑制細菌的增殖并有效延緩復合果蔬肉制品的腐敗程度，從而延長保藏時間，且其防腐保鮮效果隨著花色苷濃度的增加而提升。