鴨疫里默氏桿菌商丘流行株的分離鑒定及耐藥性分析

劉傳輝 ， 韓 楠

(1.商丘市畜產品質量監測檢驗中心 ， 河南 商丘 467000 ； 2.鶴壁市農產品檢驗檢測中心 ， 河南 鶴壁 458000)

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer,RA)引起的一種急性、接觸性傳染病，主要感染2～8周齡的雛鴨、雛鵝等水禽動物。主要表現為肝周炎、纖維素性心包炎、腦膜炎和氣囊炎病理特點[1]。1982年我國首次分離鑒定出RA[2]，病死率較高。RA在自然界廣泛存在，國際上公認RA有21個血清型，其中1型和2型為優勢血清型，不同血清型之間沒有交叉免疫保護，不同地區分離的菌株血清型也不盡相同，存在較大差異[3]。再加上獸醫臨床治療中抗菌藥物的盲目或者超劑量使用，導致細菌耐藥性非常嚴重，給該病的預防和治療造成很大困難。目前，鴨疫里默氏桿菌病是嚴重危害養鴨業、養鵝業的重要細菌性傳染病之一。本試驗從商丘市某養鴨場病鴨中分離出6株RA，感染病鴨均為15日齡左右，病理剖檢病死鴨均出現纖維素性心包炎、纖維素性肝周炎和脾腫大等相同的病變，并對6株RA進行了生物特性、耐藥性和致病性試驗，以期為商丘市鴨疫里默氏桿菌病的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 疑似感染RA的15日齡左右病死鴨來自商丘市不同縣(市、區)的養鴨場，剖檢均可見纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎病理特點。采集病死鴨的腦、心臟、肝臟和脾臟等病料，共28份。12只7日齡健康雛鴨，由商丘市綠都生態養殖有限公司提供。

1.2 主要試劑 巧克力瓊脂培養基、胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養基(含5%胎牛血清)(TSA)、胰酪大豆胨液體培養基(TSB)、LB培養基和麥康凱培養基，均由商丘市動物疫病控制中心實驗室自制。30%甘油保菌液、革蘭染液、瑞氏染液、微量生化鑒定管和藥敏試紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。鴨疫里默氏桿菌1、2型菌株和標準血清，均由河南農業大學提供。細菌基因組DNA提取試劑盒、Goldview核酸染料，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。DL2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Mix和瓊脂糖，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 細菌分離與培養 無菌采取病死鴨的腦組織、肝臟、心包積液，分別接種于巧克力瓊脂培養基和TSA培養基，置于燭缸中37 ℃恒溫箱培養 24～48 h，觀察細菌生長情況、菌落特征。分別挑取透明、露珠狀、邊緣光滑的菌落在LB培養基上進行傳代純培養，革蘭染色和瑞氏染色，在顯微鏡下觀察菌體染色特性和形態。

1.4 細菌生化鑒定 將純化的單個細菌菌落接種于葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、硫化氫、尿素、氧化酶和枸櫞酸鹽等細菌生化微量鑒定管中，置燭缸內37 ℃恒溫培養24 ～48 h，觀察記錄結果。

1.5 PCR鑒定 無菌吸取1 mL分離菌純培養物，加入100 μL PBS 溶液，經過水浴、離心處理后取上清液為 DNA 模板，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取細菌總DNA。采用細菌16S rRNA基因通用引物進行分離菌株的PCR擴增。上游引物：16S(F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG- 3′，下游引物：16S(R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT- 3′，預期擴增片段長度約為1 450 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增反應體系(25 μL)：模板 DNA 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，最后加滅菌ddH2O補至25 μL。PCR反應參數：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸 45 s，共30個循環；72 ℃再延伸5 min。取40 μL PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的條帶回收DNA凝膠純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果輸入NCBI網站中，選取參考菌株的16S rRNA 基因序列，拼接后利用MegAlign 軟件對分離菌進行同源性比對。

1.6 血清型鑒定 將鑒定為RA的分離菌接種于TSB培養基，待長出單菌落之后，挑取單菌落接種于TSB液體培養基中，振蕩培養12 h后，將菌液離心3次，用PBS將菌體重懸，作為RA分離株玻片凝集抗原。參照黃美玲等[4]報道的平板凝集試驗方法，對分離菌株進行血清型鑒定。分別以對應血清型的陽性菌株作為陽性對照，大腸埃希菌作為陰性對照、PBS作為空白對照，鑒定RA血清型。結果判定標準：菌液與血清混合后3 min內不出現顆粒狀凝集者為陰性，出現顆粒狀凝集者為陽性。

1.7 藥敏試驗 采用紙片擴散法(K-B)，挑取單個純培養菌落接種于TSB(含5%胎牛血清)，37 ℃培養24 h，生理鹽水調制菌液濃度為0.5個麥氏標準比濁管，然后吸取100 μL菌液均勻涂布在巧克力平板表面，待平板干燥后，無菌取藥敏紙片貼于巧克力瓊脂平板上，37 ℃孵育18～24 h，利用游標卡尺量取抑菌圈直徑。結果判定參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)發布的抗微生物藥物敏感性試驗執行標準(CLSI—2017)。

1.8 動物回歸試驗 將12只健康雛鴨隨機分為試驗組和對照組，每組6只。選取已鑒定的RA分離菌株接種巧克力瓊脂平板培養基，37 ℃培養24 h，生理鹽水調制菌液濃度為2.0×108CFU/mL。試驗組腿部肌內注射RA分離菌液，0.5 mL/只，對照組腿部肌內注射生理鹽水，0.5 mL/只。觀察并記錄雛鴨臨床癥狀。

2 結果

2.1 分離菌培養特性和形態特征 從28份病料中分離出6株疑似RA細菌，分別命名為SQ-RA1、SQ-RA2、SQ-RA3、SQ-RA4、SQ-RA5和SQ-RA6。細菌分離培養結果見圖1，分離株在巧克力平板培養基和TSA瓊脂平板上菌落微隆起、邊緣整齊、透明、呈露珠狀；分離菌革蘭染色鏡檢呈陰性短小桿菌，無芽孢，兩端鈍圓，多數單個存在，少數成對或鏈狀排列，長度為(0.2～0.4)μm×(1～5) μm；分離菌瑞氏染色鏡檢，呈菌體兩極濃染。符合鴨疫里默氏桿菌的形態特征。

圖1 分離菌顯微鏡觀察Fig.1 Microscopic observation of isolated strains A：分離菌在巧克力培養基上的菌落形態； B:革蘭染色(400×)A:Colony morphology of isolated strains on chocolate medium； B:Gram staining (400×)

2.2 生化鑒定 6株分離菌均不發酵葡萄糖、蔗糖和麥芽糖；V-P試驗、甲基紅試驗、硫化氫產生、甘露醇、硝酸鹽還原和枸櫞酸鹽試驗均為陰性；其中2株分離菌對氧化酶、觸酶和尿素試驗均為陽性。根據細菌形態學特征和生化特性試驗結果，6株分離菌可初步鑒定為RA。

2.3 PCR鑒定 瓊脂糖凝膠電泳成像結果顯示，6株分離菌的擴增片段大小均在1 450 bp左右(圖2)，與預期大小相符。測序比對結果顯示，分離菌與NCBI基因庫 BLAST 中的RA參考菌的16S rRNA基因序列同源性為99.4%～100.0%，均高于97.0%。結合參考文獻[5]的報道,分離菌的16S rRNA基因序列同源性為97.0%～98.9%時，可判定為同屬，同源性高于99.0%時，可判定為同種。因此，PCR鑒定結果確定6株分離菌均為RA。

圖2 16S rRNA基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA geneM:DL-2 000 Marker； 1～6:分離菌株M:DL-2 000 Marker; 1- 6:Isolated strains

2.4 血清型鑒定 經鑒定，SQ-RA1、SQ-RA3為血清1型，SQ-RA2、SQ-RA5和SQ-RA6為血清2型，SQ-RA4為未定血清型菌株。

2.5 藥敏試驗 6株分離菌的藥敏試驗結果見表1。6株分離菌對羧芐西林、氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、多西環素、頭孢氨芐6種藥物高度耐藥，耐藥率均大于80%，對復方新諾明、丁胺卡那、卡那霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林7種藥物高度敏感。

表1 分離菌株的藥敏試驗Table 1 Drug sensitivity test of isolated strains

續表

2.6 動物回歸試驗 試驗組雛鴨在攻毒8 h內，部分雛鴨臨床表現精神不振，臥地嗜睡，站立不穩；12 h內，雛鴨食欲下降或廢絕，眼鼻流出黏性分泌物，腹瀉；24 h內，雛鴨表現神經癥狀，角弓反張，雙腿麻痹，走路搖晃，并有5只雛鴨死亡，第3天試驗雛鴨全部死亡。剖檢死亡雛鴨可見心包、胸腔積液增多，纖維素性心包炎，肝臟腫大，有纖維性滲出物覆蓋表面，脾臟出現大理石樣花紋，纖維素性氣囊炎等，與鴨疫里默氏桿菌病的病理特征一致。無菌采集心臟、肝臟、脾臟等病料做細菌分離培養鑒定，結果分離出與自然分離株相一致的RA。對照組雛鴨正常，未見上述臨床癥狀。動物攻毒試驗表明，血清1型、2型和未知型分離菌均有很強的致病性。

3 討論

鴨疫里默桿菌對鴨、鵝等水禽養殖業危害嚴重，其血清型眾多，據朱曉霞等[6]報道,我國主要有18個血清型，其中1～5型血清型分布最為廣泛。不同地區的RA菌株不同，即便同一地區的養殖場，血清型種類也有所差別。周英寧等[7]報道，廣西地區主要流行株為血清1型和血清2型；陳宏智等[8]調查河南省信陽地區鴨疫里默氏桿菌病流行情況，發現以血清1型、2型和3型為主；王卓昊等[9]研究發現，蘇北及周邊地區優勢血清型為1型和未定型血清型，并且在一定時期同一地呈現多菌株多血清型流行的特點。本試驗通過細菌分離、生化試驗、血清型鑒定和PCR鑒定，從商丘不同地區養鴨場疑似感染RA的28份病死鴨中成功分離出6株RA菌株，主要血清型分布為血清1型和2型，分離率為21.43%(6/28)，表明商丘地區RA流行株與以上報道結果基本一致。因此，開展RA血清型調查，摸清當地和場內優勢菌株，對準確防控鴨疫里默桿菌病具有重要意義。

文獻報道顯示，通過不同注射途徑感染RA的鴨，其發病率和死亡率差別較大,其中肌內注射發病率和死亡率均達到100%，而腹腔、頸部皮下、腳蹼等其他途徑感染RA的發病率和死亡率相對較小[10-12]。因此，肌內注射是評價RA致病力的首選途徑。本試驗中的動物回歸試驗選用肌內注射，第3天試驗雛鴨全部死亡，證實了肌內注射感染RA，雛鴨的病死率很高，并且血清1型和2型RA致病力很強。

長期以來，RA的防治依靠抗生素，由于臨床用藥不規范，盲目用藥，隨意加大劑量，使得RA產生的耐藥性不斷增加，多重耐藥現象也非常普遍，同時，不同地區的分離菌株對抗生素的敏感性存在差別，這給鴨疫里默氏桿菌病的防治帶來很大困難。因此，在選用抗生素之前，應先進行藥敏試驗，根據結果選擇敏感的藥物，避免因耐藥性帶來經濟損失。本次藥敏試驗結果顯示，RA分離菌對羧芐西林、氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、多西環素、頭孢氨芐6種藥物高度耐藥，對復方新諾明、丁胺卡那、卡那霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林7種藥物高度敏感，建議選擇敏感藥物作為商丘地區臨床治療藥物。科學用藥，根據本地區、本場的優勢血清型，選擇免疫原性較好的菌株疫苗開展免疫防治，是有效防控該病的重要途徑。