重組牛乳鐵蛋白多肽對沙門菌抑菌作用機制研究

李海濤 ， 張 宇 ， 劉艷環 ， 桑 銳 ， 葛冰潔 ， 周鴻緣 ， 王 巍 ， 苗利光 ， 張雪梅

(1.延邊大學農學院 ， 吉林 延吉 133002 ； 2.中國農業科學院特產研究所 ， 吉林 長春 130112)

牛乳鐵蛋白(Bovine lactoferrin，bLf)是一種鐵結合糖蛋白，分子量約為80 kDa，在牛乳汁中廣泛存在，尤其在牛初乳中含量較高，具有免疫調節、抗氧化、殺菌和抗腫瘤等生物活性功能[1-3]。牛乳鐵蛋白廣泛應用于調制乳、風味發酵乳和含乳飲料中，并且作為營養強化劑用于嬰幼兒配方奶粉及食品中[4-5]。

牛乳鐵蛋白的重要生物學作用之一是抗菌，其具有抑菌譜廣、天然、無毒等抗菌特點，近年來被研究者廣泛關注。重組牛乳鐵蛋白多肽(Recombinant bovine lactoferrin polypeptide，rbLfP)是從牛乳鐵蛋白分子的N-末端分離到的1條多肽[6]，是經基因改造后由畢赤酵母真核表達載體分泌表達的一種重造蛋白質，具有高效廣譜的抗菌活性，對動物臨床常見雞白痢沙門菌[7]、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌[8]等病原菌均有很好的抑菌活性，未來將會在養殖替抗應用領域有突破性研究進展。

目前，對rbLfP的研究主要集中在理化性質[9]、發酵工藝[10]、質量鑒定[9]等方面，對其抗菌機制的研究相對較少。本試驗從rbLfP對沙門菌的體外最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)、細胞膜損傷作用和對細菌基因組DNA的相互作用影響等方面研究rbLfP對沙門菌抑菌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 rbLfP溶液(2 000 μg/mL)由中國農業科學院特產研究所獸用生物藥創制技術中試平臺提供；Mueller-Hinton(MH)肉湯培養基、瓊脂粉，均購自北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司；PURExpressTM體外蛋白合成試劑盒，購自紐英倫生物技術(北京)有限公司。

1.2 主要儀器 MultiskanSkyHigh全波長酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品；Bio-RadSynergy H1光譜儀，伯樂(上海)生命科學研究發展有限公司產品；THZ-98A恒溫振蕩培養箱、BPH-9402精密恒溫培養，上海一恒科學儀器有限公司產品。

1.3 菌株 沙門菌選用雞白痢沙門菌(CVCC1790)，中國農業科學院特產研究所保存。

1.4 rbLfP對沙門菌體外最小抑菌濃度(MIC)測定 取rbLfP溶液，使用無菌水進行倍比稀釋至濃度分別為128、64、32、16 μg/mL和8 μg/mL，備用。體外MIC的測定方法參照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準，具體步驟：挑取過夜培養的MH肉湯瓊脂平板上的沙門菌單菌落，接種于MH肉湯液體培養基中，37 ℃培養16 h，調整菌液濃度為1.0×106CFU/mL，作為菌懸液備用；向無菌96孔培養板中各加入180 μL菌懸液，每行設置樣品孔和陰性對照孔，樣品孔分別加入濃度為128、64、32、16 μg/mL和8 μg/mL的rbLfP稀釋液20 μL，設置3個平行，同時設置3個菌懸液空白對照孔[11-12]，陰性對照孔內加入20 μL無菌水。37 ℃恒溫培養箱培養16 h，每隔2 h采樣1次，測定OD600 nm值，無細菌生長的最低rbLfP濃度即為MIC。

1.5 rbLfP對沙門菌細胞膜的損傷作用

1.5.1 rbLfP作用沙門菌后胞外核酸和蛋白質濃度的變化 取對數生長期的沙門菌菌液，用MH肉湯液體培養基稀釋至1.0×106CFU/mL，分別加入rbLfP至終濃度為1×MIC(1×MIC組)、2×MIC(2×MIC組)，空白對照組(CK)加入等量的無菌水，混勻，于37 ℃保溫孵育，于0、2 h和4 h取樣，10 000 r/min離心10 min，取上清液于260 nm、280 nm測定其吸光度值，分析細菌胞外核酸和蛋白質濃度變化規律[13-14]。

1.5.2 rbLfP作用沙門菌后基因組DNA濃度的變化 取對數生長期的沙門菌菌液，用MH肉湯液體培養基稀釋至1.0×106CFU/mL，加入rbLfP至終濃度為1×MIC(1×MIC組)、2×MIC(2×MIC組)，設置空白對照組(CK)，加入等量的無菌水，混勻，于37 ℃保溫孵育16 h，然后使用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組，于260 nm測定其吸光度值，分析基因組DNA濃度變化規律。

1.5.3 rbLfP對沙門菌細胞膜滲透性的影響 通過測定細胞膜電導率來檢測rbLfP對沙門菌細胞膜滲透性的影響，按照參考文獻[15]的方法進行。取在對數生長期的沙門菌，OD600 nm為0.8～1.0，使用PBS溶液清洗3次，并用PBS溶液重懸菌體使之混勻，加入rbLfP并使其終濃度為1×MIC(1×MIC組)，將處理的沙門菌懸液在37 ℃、160 r/min條件下孵育培養。每隔2 h取樣1次，3 000 r/min離心15 min，取上清液測定電導率值；然后加熱煮沸處理20 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液測定電導率值。設置空白對照組(CK)，使用等體積去離子水代替rbLfP。

按照公式(1)，用電導率值計算相對滲透率，使用相對滲透率表示細胞膜的滲透性。

K/%=(J1-J0)/(J2-J0)×100%

(1)

其中：K為采用時間的相對滲透率(%)，J0為起始時間的電導率(ms/cm)，J1為采樣時間的電導率(ms/cm)，J2為采樣時間煮沸處理后的電導率(ms/cm)。

1.6 rbLfP對基因組DNA的相互作用影響

1.6.1 rbLfP對體外蛋白質合成的抑制作用 按照PURExpressTM體外蛋白合成試劑盒說明書，加入rbLfP終濃度分別為1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC和16×MIC，設置空白對照組(CK)和陽性對照組，不加S70、rbLfP的為空白對照組，不加rbLfP的為陽性對照組。反應結束后，使用酶標儀于280 nm測定其吸光度值[16]。

按照公式(2)計算蛋白合成速率，反應rbLfP對蛋白質合成的抑制作用。

ps/%=Δb/Δa×100%

(2)

其中：ps為相對蛋白質合成速率(%)，Δb為rbLfP處理組吸光值曲線的斜率，Δa為陽性對照組吸光值曲線的斜率。

1.6.2 DNA凝膠阻滯試驗 將生長至對數期的沙門菌10 000 r/min離心10 min，然后用PBS清洗3次，再用PBS重懸菌體，按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進行DNA提取，使用紫外分光光度計測定OD260 nm，并用1×TE溶液稀釋提取的DNA，使其濃度在OD260 nm為1.8左右[17]。取10 μL細菌基因組DNA分別與1×MIC、2×MIC的rbLfP等體積混合，設置生理鹽水空白對照組(CK)，37 ℃靜止培養30 min。反應結束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察rbLfP與DNA相互作用后的凝膠阻滯結果。

1.6.3 熒光光譜分析rbLfP與DNA相互作用方式 參照參考文獻[18-19]方法，在96孔板中加入濃度為50 μg/mL的沙門菌基因組DNA和100 μg/mL的EB溶液10 μL，然后分別加入1×MIC、2×MIC的rbLfP混勻，設置生理鹽水空白對照組(CK)，混合均勻后置于培養箱中37 ℃避光反應30 min。結束后，用Bio-Rad Synergy H1光譜儀在波長550～750 nm進行光譜分析。

1.7 數據處理 試驗數據采用Excel 2019進行整理，采用SPSS軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，數據結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 rbLfP對沙門菌體外MIC測定 將rbLfP濃度從128 μg/mL倍比稀釋至8 μg/mL后作用于沙門菌，37 ℃培養16 h，每隔2 h采樣1次并測定OD600 nm值。結果如圖1所示，rbLfP質量濃度與OD600 nm值呈線性反比關系，隨著rbLfP質量濃度變大，OD600 nm值變小，說明rbLfP質量濃度越大對沙門菌的抑制作用越強。與空白對照孔(0 μg/mL)相比，樣品孔均對沙門菌生長產生了抑制作用，當rbLfP濃度為32 μg/mL時，rbLfP基本抑制了沙門菌的生長；當rbLfP濃度在32 μg/mL以上時，培養時間從4 h后，OD600 nm值越來越小，細菌繁殖受到了明顯的抑制。因此，rbLfP對沙門菌體外MIC為32 μg/mL。

圖1 rbLfP對沙門菌體外最小抑菌濃度的測定Fig.1 MIC of rbLfP against Salmonella in vitro

2.2 rbLfP對沙門菌細胞膜的損傷作用

2.2.1 rbLfP作用沙門菌后胞外核酸和蛋白質濃度的變化 結果如圖2、圖3所示，在1×MIC、2×MIC的rbLfP作用下培養2 h，培養液中的核酸和蛋白質含量升高，與空白對照比較差異顯著(P<0.05)；rbLfP作用4 h，相比培養2 h培養液中的核酸和蛋白質含量均有所升高，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。可見rbLfP作用于沙門菌導致細菌培養液在260 nm和280 nm吸光度有明顯變化，說明細胞膜的通透性變大，細胞膜完整性受損；同時，可以觀察到胞內大分子物質核酸和蛋白質透膜泄漏變化與rbLfP的濃度和作用時間呈線性正相關。結果表明，rbLfP可以改變沙門菌細胞膜的完整性，導致細胞內核酸和蛋白質外漏，從而抑制菌體正常生長和繁殖。

圖2 rbLfP作用沙門菌后胞外核酸濃度的變化Fig.2 Concentration changes of extracellular nucleic acid of Salmonella treated with rbLfP與空白對照組比較，a：P<0.05；下圖同Compared with CK group,a：P<0.05. The same as below

圖3 rbLfP作用沙門菌后胞外蛋白質濃度的變化Fig.3 Concentration changes of extracellular protein of Salmonella treated with rbLfP

2.2.2 rbLfP作用沙門菌后基因組DNA濃度的變化 結果如圖4所示，rbLfP與沙門菌共培養2 h，1×MIC組細菌基因組DNA濃度比空白對照組低，但差異不顯著(P>0.05)，2×MIC組細菌基因組DNA的濃度明顯較空白對照組低，且結果差異顯著(P<0.05)；在共培養4 h時，空白對照組的細菌基因組DNA濃度明顯升高，1×MIC組和2×MIC組的細菌基因組DNA濃度明顯降低，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。隨著rbLfP濃度的升高和作用時間的延長，細菌基因組DNA濃度逐漸減少，表明rbLfP對沙門菌的抑殺過程中，細菌基因組DNA的外泄與rbLfP的濃度和作用時間呈正相關。結果表明，rbLfP在一定濃度時可以有效抑制細菌基因組DNA的復制，從而起到抑菌、殺菌作用。

圖4 rbLfP對沙門菌基因組DNA的影響Fig.4 Effects of rbLfP on genomic DNA of Salmonella

2.2.3 rbLfP對沙門菌細胞膜滲透性的影響 通過檢測電導率，利用相對滲透率來表示細菌細胞膜損傷后通透性的改變。如圖5所示，1×MIC的rbLfP與沙門菌共培養后，隨著時間變化，相對滲透率變大，在4 h之后，1×MIC組的相對滲透率與空白對照組比較，差異顯著(P<0.05)；到6 h后變化趨緩基本穩定。說明rbLfP可以改變沙門菌細胞膜的通透性，與通透性相關的金屬離子從胞內向胞外滲出，導致細胞內環境改變；rbLfP對沙門菌的作用方式之一是通過改變細胞膜的通透性，進而可能影響胞內外物質轉運、代謝等功能，從而起到抑制沙門菌生長的作用。

圖5 rbLfP對細胞膜相對滲透率的影響Fig.5 Effects of rbLfP on relative permeability of cell membrane

2.3 rbLfP對基因組DNA的相互作用影響

2.3.1 rbLfP對蛋白質合成的抑制作用 為研究rbLfP對細胞胞內蛋白質合成的抑制作用，選用體外無細胞蛋白合成系統，進行蛋白質合成抑制試驗。結果見圖6，rbLfP對蛋白質合成抑制作用呈現一定的劑量依賴效應，較低濃度的rbLfP對蛋白質合成抑制作用不明顯，8×MIC的rbLfP對蛋白質合成速率為79%，抑制率為21%，16×MIC的rbLfP蛋白質合成速率為54%，抑制率為46%，對蛋白質合成抑制速率效果更明顯。因此，rbLfP可以通過影響細菌胞內蛋白質的合成來抑殺細菌，且抑殺效果與rbLfP的濃度呈正相關。

圖6 rbLfP對體外蛋白質合成的影響Fig.6 Effects of rbLfP on protein synthesis in vitro

2.3.2 rbLfP對細菌基因組DNA凝膠阻滯試驗 結果如圖7所示，在凝膠電泳時，rbLfP與DNA的結合物在瓊脂糖凝膠上的遷移速率比DNA慢；rbLfP可以與EB競爭性結合細菌基因組DNA，隨著rbLfP濃度增加，DNA的遷移速率越慢，但沒有達到完全阻斷DNA遷移的水平。由此可見，rbLfP可能通過改變細菌細胞膜的通透性進入細菌菌體后與胞內DNA的作用靶點發生作用，影響細菌基因組DNA的復制，由于rbLfP在2×MIC的濃度下，未能完全阻斷DNA的遷移，因此rbLfP與DNA直接結合的能力有限，所以，此途徑不一定是主要抑菌途徑。

圖7 rbLfP與細菌基因組DNA結合的凝膠阻滯試驗Fig.7 Gel retardation analysis of rbLfP binding to bacterial genomic DNA

2.3.3 熒光光譜分析rbLfP與DNA的作用影響 結果如圖8所示，濃度在1×MIC、2×MIC時，rbLfP與基因組DNA的結合能力比較有限，在550～750 nm的紫外吸收光譜發生變化，600 nm和650 nm的吸收峰發生位移，高度降低，但影響作用有限，結果差異不顯著(P>0.05)。結果表明，可能是rbLfP分子中的氨基酸與細菌基因組DNA的磷酸骨架結合，抑或是與DNA分子發生溝槽作用，影響細菌基因組DNA的復制。

圖8 rbLfP與DNA相互作用的熒光光譜分析Fig.8 Fluorescence spectrum analysis of rbLfP interaction with DNA

3 討論

牛乳鐵蛋白的抗菌功能是其主要生物學功能之一，也是較早被發現的生物學功能，對常見的病原細菌諸如大腸桿菌、沙門菌[20]、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、結核分枝桿菌等均有良好的抑菌效果[21-22]。Evelien等在研究牛乳鐵蛋白對溶血性大腸桿菌的作用時發現，通過直腸給藥能夠對出血性大腸桿菌O157∶H7在牛體內的感染進行有效的治療，同時可以調節牛的機體免疫力[23]。周恬等研究表明，口服牛乳鐵蛋白能抑制牙齦卟啉單胞菌的生長繁殖，對牙周組織炎癥有很好的控制作用[24]。

牛乳鐵蛋白的抗菌機制如何，是通過何種途徑進行抑制細菌繁殖生長的呢？目前對牛乳鐵蛋白抑菌機制的研究較少，而與之同源性最相近的乳鐵蛋白抑菌機制則研究較多。有研究表明，乳鐵蛋白的抑菌機制與其特殊的分子結構有關系。乳鐵蛋白表面某些結構能夠與細菌表面分子非特異性結合，對細菌細胞膜上的通道位點能夠有效的封閉，進而通過封閉通道位點來阻斷營養物質和菌體內合成蛋白的轉運，從而抑制細菌的合成與代謝[25]。乳鐵蛋白的分子結構中含有氨基末端強陽離子結合區域，使得其帶正電荷，可通過其與革蘭陰性菌表面的脂多糖(陽離子區)相互作用，與帶負電荷的細胞表面成分有很強的親和性，可黏附于細菌的細胞膜，從而增強細胞膜的通透性，使細菌的脂多糖從外膜滲出，導致菌體內部的核酸和蛋白質泄漏，起到裂解細菌、抑制細菌生長繁殖的作用[26-27]。

核酸和蛋白質是細菌細胞內兩類重要的大分子物質，在正常生理狀態條件下，不能穿透細胞膜，但當藥物或者其他刺激源對細菌細胞膜完整性造成破壞時，核酸和蛋白質會通過細胞膜上特定孔道釋放到細胞外，利用核酸在260 nm、蛋白質在280 nm處有較強的紫外吸收，可以通過檢測培養液中核酸和蛋白質紫外吸收強度的變化規律來判斷細菌細胞膜的完整性[28-29]。

本試驗對rbLfP抑制沙門菌生長繁殖的機制進行了探索，結果顯示，rbLfP對沙門菌的體外MIC為32 μg/mL時，可以有效抑制菌體生長繁殖。對rbLfP抑菌機制的進一步研究結果顯示，在1×MIC、2×MIC的rbLfP作用下培養2 h，沙門菌培養液中的核酸和蛋白質含量均升高，結果與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，rbLfP與細菌共培養4 h，培養液中的核酸和蛋白質含量明顯升高，與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。通過對細胞膜滲透率的變化研究表明，rbLfP可以通過改變沙門菌細胞膜表面的通透性，使細胞膜相對滲透率變大，對菌體細胞膜的完整性造成損傷，導致菌體內金屬離子、核酸和蛋白質泄漏，起到抑菌作用，且rbLfP濃度越高，抑菌作用效果越明顯。

研究表明，EB是一種非常典型的靈敏度高、選擇性好的嵌入式熒光探針，其本身的熒光很弱。EB與DNA作用，EB的生色基團插入DNA堿基序列中，插入形式是以較高親和力嵌入DNA的雙鏈內部的堿基對之間，EB與DNA結合后熒光強度將會大幅度增強[30]。rbLfP與EB共存于DNA體系時，rbLfP與EB則相互競爭與DNA的結合，導致EB與DNA結合的能力變弱，在熒光光譜檢測時，表現為熒光光譜強度降低。蛋白質可以與DNA的雙螺旋表面通過靜電作用的方式相結合，同時可以與顯色液EB競爭性結合DNA，在凝膠電泳時蛋白質與DNA結合的復合物比EB與DNA結合產物的遷移速率慢，發生拖尾等現象[31]。體外蛋白質合成速率試驗驗證了rbLfP在體外有一定的抑制蛋白質合成的效果。本試驗中熒光光譜分析rbLfP與DNA磷酸骨架的影響結果顯示，rbLfP使沙門菌DNA的吸收峰發生位移，高度降低，但影響作用有限，結果差異不顯著(P>0.05)，可能是rbLfP分子中的氨基酸與細菌基因組DNA的磷酸骨架結合，抑或是與DNA分子發生溝槽作用，影響細菌基因組DNA的復制，抑制沙門菌的生長繁殖，起到抑菌殺菌效果。

本試驗揭示了rbLfP對沙門菌抑菌的作用機制：rbLfP可通過改變沙門菌細胞膜的通透性，可能是rbLfP對沙門菌抑菌的主要作用途徑；同時其與細胞內DNA相互作用，抑制菌體DNA復制，起到一定抑菌作用，可以與膜損傷抑菌途徑共同作用，但不是主要抑菌作用途徑。本試驗結果為下一步研究rbLfP抑菌的分子機理提供了科學依據。