新鮮雞肉中奇異變形桿菌定量PCR 檢測(cè)與耐藥性分析

劉 迎，劉利強(qiáng)，李慧芳，劉 娜，劉彥威，杜 娟

（1. 河北交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056021）

0 引言

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis） 是好氧兼性厭氧菌，屬于腸桿菌科（Proteobacteriaceae） 變形桿菌屬（Proteobacteriaceae） 細(xì)菌，呈G+，廣泛分布于生活用水、土壤、人和動(dòng)物體內(nèi)，是一種機(jī)會(huì)致病菌[1]。奇異變形桿菌除了可以引起人和動(dòng)物發(fā)生敗血癥等疾病以外，也能夠通過(guò)加熱不徹底的食物進(jìn)入人體，引發(fā)食物中毒。食物中奇異變形桿菌的污染率為3.8%～100.0%，以動(dòng)物源食品帶菌率較高，特別是新鮮肉，在全國(guó)已屢次發(fā)生消費(fèi)者食用被奇異變形桿菌污染的食品引發(fā)食物中毒的事件[2]。

熒光定量PCR 技術(shù)是針對(duì)細(xì)菌高度保守序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具有結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、污染小、重復(fù)性好、標(biāo)準(zhǔn)化操作等特點(diǎn)，已用于食品中致病菌的檢測(cè)[3]。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于熒光定量PCR方法檢測(cè)新鮮雞肉中奇異變形桿菌的研究比較少見(jiàn)。近年來(lái)，由于抗生素在食品動(dòng)物中的不規(guī)范使用，奇異變形桿菌耐藥性已廣泛傳播，但不同來(lái)源的菌株耐藥性卻大不相同，目前還未見(jiàn)新鮮雞肉源奇異變形桿菌耐藥性報(bào)道[4]。為此，建立熒光定量PCR 檢測(cè)方法對(duì)河北省某地市場(chǎng)現(xiàn)售新鮮雞肉奇異變形桿菌污染進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)新鮮雞肉中分離到的菌株進(jìn)行耐藥性分析，了解本地流行株的耐藥特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LB 肉湯、SS 瓊脂培養(yǎng)基、MHA 瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司提供；熒光定量PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司提供；Oxoid 藥物敏感性試驗(yàn)紙片：分別為四環(huán)素（TCY）、強(qiáng)力霉素（DOX）、青霉素（PEN）、阿莫西林（AMX）、氨芐西林（AMP）、氯霉素（CHL）、鏈霉素（STR）、卡那霉素（KAN）、慶大霉素（GEN）、壯觀霉素（SPT）、甲氧芐氨嘧啶（TMP）、磺胺甲惡唑（SMZ）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、紅霉素（ERY）、林可霉素（LIN）、克林霉素（CLI），共17 種，均為Oxiod Ltd Basingstoke Hampshire England 公司提供；藥敏質(zhì)控菌株為ATCC 25922 大腸埃希菌，中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保藏中心提供。

1.2 引物種類(lèi)

細(xì)菌通用引物16S rDNA：上游引物F：5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'，下游引物R：5'-GAGTT TGATCMTGGCTCAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為750 bp。奇異變形桿菌的尿素酶基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（CP034090） ， 上 游 引 物 為 qrrA-F:5， -TTTATCAAAGCCTCAAACCC-3， 下 游 引 物 為 qrrA-R:5，-TGCGTCACCCTCTAACTCATC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為395 bp。細(xì)菌通用引物16S rDNA 和奇異變形桿菌qrrA 特異性引物由奧美德諾（北京） 基因科技有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

在河北省某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)用無(wú)菌棉簽涂抹新鮮雞肉表面，然后放入無(wú)菌離心管中并作標(biāo)記，低溫送回實(shí)驗(yàn)室，共計(jì)100 份樣品。

1.3.2 細(xì)菌分離

將采集的雞肉樣品在SS 瓊脂上進(jìn)行劃線分離，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h。觀察菌落大小、顏色、形態(tài)、邊緣整齊度和光滑度等細(xì)菌菌落特征。挑取可疑變形桿菌的菌落進(jìn)行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察。

1.3.3 奇異變形桿菌鑒定

奇異變形桿菌采用分子生物學(xué)的鑒定方法，即利用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。挑取SS 瓊脂上疑似奇異變形桿菌單菌落，按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明提取奇異變形桿菌DNA，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。對(duì)測(cè)到的序列結(jié)果登錄https://www.ncbi.nlm.nih.gov/在線BLAST，進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果相似大于97%以上的即可確定為奇異變形桿菌。奇異變形桿菌PCR 反應(yīng)采用 25 μL 體系。

奇異變形桿菌PCR 反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 奇異變形桿菌PCR 反應(yīng)體系/μL

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃-5 min；變性94 ℃-40 s，退火 60 ℃-30 s；延伸 72 ℃-55 s，共35 個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。

1.3.4 奇異變形桿菌熒光定量PCR 的建立

（1） qPCR 擴(kuò)增。①熒光定量PCR 反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq（2×） 12.5 μL，上游引物 F1、下游引物下游引物F2分別加入1 μL，加入Proteus DNA 模板 1.0 μL，再加入滅菌的雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體系，共25 μL。②qPCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性、變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間分別為94 ℃-4 min，94 ℃-15 s，56 ℃-35 s，72 ℃-30 s，反應(yīng) 40 個(gè)循環(huán)（cycle），再72 ℃-10 min 延伸，保存于4 ℃，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

（2） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。奇異變形桿菌在LB 肉湯增菌培養(yǎng)，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板涂布法測(cè)定分離到的奇異變形桿菌菌液濃度。用LB 肉湯稀釋最后調(diào)整奇異變形桿菌濃度為106CFU/mL 后提取奇異變形桿菌DNA，將106CFU/mL 奇異變形桿菌菌液的DNA以10x倍比系列用無(wú)菌雙蒸水進(jìn)行稀釋至相當(dāng)于101CFU/mL 奇異變形桿菌菌液的DNA。經(jīng)qPCR 擴(kuò)增后，以奇異變形桿菌菌液濃度（CFU/mL） 為橫坐標(biāo)，以PCR 反應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct 值） 為縱坐標(biāo)繪制濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3） 特異性試驗(yàn)。奇異變形桿菌和雞肉中常見(jiàn)的7 種常見(jiàn)致病菌為對(duì)照菌株，分別為沙門(mén)氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腸球菌 （Enterococcus）、鏈球菌 （Streptococcus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae） 的基因組DNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)構(gòu)建方法的特異性。

（4） 敏感性試驗(yàn)。以雞肉中奇異變形桿菌qPCR反應(yīng)和普通PCR 反應(yīng)分析比較，檢測(cè)所構(gòu)建qPCR方法的敏感性，以101～106CFU/mL 奇異變形桿菌DNA 6 個(gè)濃度梯度分別進(jìn)行普通PCR 和qPCR 擴(kuò)增，以2 種方法所能檢測(cè)到最低濃度來(lái)比較敏感性的差異。

（5） 重復(fù)性試驗(yàn)。從雞肉中分離到奇異變形桿菌為出發(fā)點(diǎn)，在不同濃度DNA 梯度中隨機(jī)選擇2 個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度分別為3 個(gè)重復(fù)，對(duì)構(gòu)建方法的重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn)，根據(jù)奇異變形桿qPCR 反應(yīng)的Ct 值計(jì)算2 個(gè)濃度組之間變異系數(shù)（CV/%），檢查奇異變形桿菌qPCR 檢測(cè)方法穩(wěn)定性。

（6） 組織樣品檢測(cè)。將在市場(chǎng)采集的新鮮雞肉樣品用無(wú)菌棉簽進(jìn)行涂抹后，置于LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h，按照試劑盒操作說(shuō)明提取DNA，設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品，用所構(gòu)建的熒光定量PCR 方法對(duì)采集的雞肉新鮮樣品檢測(cè)，根據(jù)的Ct 值計(jì)算雞肉中奇異變形桿菌數(shù)量，評(píng)價(jià)所構(gòu)建方法的實(shí)用性。

1.3.5 藥物敏感性檢測(cè)

按WHO 推薦的K-B 紙片法進(jìn)行奇異變形桿菌的抗菌藥物敏感性分析。挑取SS 瓊脂上生長(zhǎng)并用分子生物學(xué)方法鑒定為奇異變形桿菌的菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)搖菌（180 r/min） 培養(yǎng)6～8 h，調(diào)整菌液含量為108CFU/mL。吸取100 μL 菌液涂布于MHA 瓊脂培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片輕輕置于培養(yǎng)基表面，稍按壓使藥敏片與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，18～24 h 進(jìn)行培養(yǎng)后測(cè)量藥敏片抑菌圈直徑。根據(jù)美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLS，2006） 最新頒布的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定奇異變形桿菌對(duì)選用的17 種抗生素的耐藥結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 奇異變形桿菌的分離

在100 份樣品中，有68 份樣品在SS 瓊脂上長(zhǎng)有疑似奇異變形桿菌的菌落，特征為表面光滑，圓形、扁平、中等大小、中心呈黑色。染色后鏡檢顯示菌體革蘭陰性菌，多數(shù)為桿狀、兩端鈍圓，少部分為絲狀。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

樣品經(jīng)PCR 擴(kuò)增、測(cè)序，基因比對(duì)，結(jié)果表明此次在68 份疑似變形桿菌中鑒定出66 株奇異變形桿菌，其分離率為66.0%。

2.3 奇異變形桿菌熒光定量PCR 的檢測(cè)

2.3.1 奇異變形桿菌引物的特異性

奇異變形桿菌經(jīng)尿素酶qrrA 特異性引物PCR 擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳形成一單條帶，片段約為395 bp，與設(shè)計(jì)引物的預(yù)期基因片段大小相同。經(jīng)基因測(cè)序、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov） 比對(duì)，所擴(kuò)增序列與基因庫(kù)奇異變形桿菌尿素酶基因的相似度為99.91%。

2.3.2 定量PCR 特異性

經(jīng)定量PCR 擴(kuò)增后形成單一擴(kuò)增曲線和熔解曲線，而沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢菌、陰溝腸桿菌都沒(méi)有擴(kuò)增曲線和熔解曲線，說(shuō)明該方法能夠區(qū)分奇異變形桿菌和雞肉其他中常見(jiàn)的治病菌。

熒光定量PCR 結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 .3 敏感性試驗(yàn)

以奇異變形桿菌DNA 相當(dāng)于菌液106～101CFU/mL的6 個(gè)菌落總數(shù)用普通PCR 檢測(cè)、qPCR 分別上機(jī)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)定量PCR 方法可以檢測(cè)到1×101CFU/mL（圖2），常規(guī)PCR 檢測(cè)到1×103CFU/mL（圖3），結(jié)果顯示熒光定量PCR 的敏感度比常規(guī)PCR 高100 倍。

奇異變形桿菌qPCR 擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2，奇異變形桿菌DNA 6 個(gè)菌落總數(shù)PCR 電泳見(jiàn)圖3。

圖2 奇異變形桿菌qPCR 擴(kuò)增曲線

圖3 奇異變形桿菌DNA 6 個(gè)菌落總數(shù)PCR 電泳

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將106CFU/mL 奇異變形桿菌提取DNA 后，隨機(jī)選擇了106和1042 個(gè)菌落總數(shù)，用SYBR Green I熒光定量PCR 進(jìn)行了3 次擴(kuò)增，根據(jù)反應(yīng)后的Ct 值計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)（CV%），Ct 值的變異系數(shù)分別為1.3%，0.9%，均比2%低，證明構(gòu)建的奇異變形桿菌檢測(cè)方法穩(wěn)定性較好。結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線和熔解曲線在相同菌落總數(shù)的3 個(gè)重復(fù)基本一致（圖4）。

奇異變形桿菌熒光定量PCR 變異系數(shù)見(jiàn)表2，熒光定量PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

表2 奇異變形桿菌熒光定量PCR 變異系數(shù)

圖4 熒光定量PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 熒光定量PCR 檢測(cè)

用無(wú)菌棉簽在新鮮雞肉表面進(jìn)行涂抹后及時(shí)置于無(wú)菌LB 肉湯離心管中，于37 ℃下培養(yǎng)1 h 后按照試劑盒說(shuō)明提取新鮮雞肉DNA，加入PCR 反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，檢測(cè)呈陽(yáng)性樣品有Ct 值，呈陰性樣品對(duì)照無(wú)Ct 值，所采集的100 份新鮮雞肉中有66 份（66.0%） 檢出了奇異變形桿菌。

樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 樣品檢測(cè)結(jié)果

2.4 奇異變形桿菌耐藥性結(jié)果

根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)判定，在新鮮雞肉分離的66 株奇異變形桿菌對(duì)養(yǎng)殖中常用的17 種抗生素均有不同程度的耐藥，其中對(duì)鏈霉素、紅霉素、林可霉素、克林霉素100%耐藥，對(duì)青霉素耐藥率較低，為19.7%（13/66）。奇異變形桿菌表現(xiàn)為多重耐藥性，最低為四重耐藥，共6 株；最高為九重耐藥，共3 株；此外，五重耐藥菌7 株，六重耐藥菌19 株，七重耐藥菌26 株，八重耐藥菌5 株。

66 株奇異變形桿菌對(duì)17 種抗生素的敏感性結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 66 株奇異變形桿菌對(duì)17 種抗生素的敏感性結(jié)果

3 結(jié)論

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis） 是肉類(lèi)食品常見(jiàn)的污染菌之一，常常通過(guò)消毒不徹底的肉食品進(jìn)入人體，引起食物中毒。目前，國(guó)內(nèi)因奇異變形桿菌引起的家庭性食物中毒呈逐年增加趨勢(shì)，對(duì)消費(fèi)者的健康造成很大的傷害，對(duì)經(jīng)濟(jì)造成很大的損失。為此必須加強(qiáng)新鮮肉類(lèi)食品的檢測(cè)，以保證消費(fèi)者的食品安全。目前，國(guó)家還未制定相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5]，常用的檢測(cè)方法是傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)包括奇異變形桿菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定等方法，這些方法具有很高準(zhǔn)確度但操作起來(lái)繁瑣，不適合日常食品衛(wèi)生檢測(cè)工作，急需建立一種實(shí)用、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法，熒光定量PCR 檢測(cè)方法時(shí)間短、高通量、特異性強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)致病菌的檢測(cè)，可用于對(duì)新鮮雞肉樣品的檢測(cè)。

張海霞等人[6]研究發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌與雞肉中常見(jiàn)的沙門(mén)氏菌有交叉抗原，用血清學(xué)方法檢測(cè)容易出現(xiàn)交叉凝集，發(fā)生漏檢或錯(cuò)檢。該研究建立的定量PCR 方法可以區(qū)分奇異變形桿菌和沙門(mén)氏菌，防止假陽(yáng)性的出現(xiàn)，可以用于新鮮雞肉樣品的檢測(cè)。食品特別是新鮮肉類(lèi)食品受到奇異變形桿菌的污染情況較為嚴(yán)重，陳善嬌等人[7]對(duì)中山市某市場(chǎng)出售的268 份新鮮肉類(lèi)食品中采用普通PCR 檢出了117 份樣品攜帶奇異變形桿菌，總攜帶率為43.7%，其中新鮮雞肉攜帶率最高，陽(yáng)性率為51.6%。郭玉梅等人[8]通過(guò)菌株分離、生化鑒定的方法在154 份熟肉制品中鑒定出30 份（19.5%） 奇異變形桿菌陽(yáng)性樣品。畢水蓮等人[9]對(duì)奇異變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株采用普通PCR和qPCR 2 種檢測(cè)方法相比，普通PCR 和熒光定量PCR 對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有一致性，但是相對(duì)于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的檢測(cè)周期長(zhǎng)、要求高的不足，熒光定量PCR完成檢測(cè)的時(shí)間為2～3 h，奇異變形桿菌熒光定量PCR 檢測(cè)方法能夠大大節(jié)省時(shí)間。王慧[10]采用普通PCR方法檢測(cè)雞源奇異變形桿菌敏感度為104CFU/mL，該研究中常規(guī)PCR 檢測(cè)限為103CFU/mL 和定量PCR檢測(cè)限為101CFU/mL，定量PCR 方法比常規(guī)PCR 方法靈敏度高100 倍，具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。

奇異變形桿菌耐藥性相對(duì)嚴(yán)重，菌體本身攜帶耐藥性R 質(zhì)粒能夠在同種屬不同菌株甚至不同種屬的細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并形成復(fù)合R 質(zhì)粒，導(dǎo)致菌體抵御抗菌藥物的進(jìn)化加快，耐藥性增加[11]。何欣怡等人[12]對(duì)雞源奇異變形桿菌的耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)株菌對(duì)紅霉素、四環(huán)素耐藥率為100%（7/7）。梁紫璐等人[13]對(duì)臨床分離的奇異變形桿菌耐藥性結(jié)果表明，菌株對(duì)紅霉素的耐藥率為97.4%（75/77），對(duì)四環(huán)素的耐藥率為72.73%（56/77）。孫冷寧等人[14]對(duì)來(lái)源于市場(chǎng)所售鮮肉的奇異變形桿菌耐藥性分析也表明，奇異變形桿菌對(duì)鏈霉素等18 種抗菌藥物的耐藥性較為嚴(yán)重，其中對(duì)鏈霉素、紅霉素耐藥率為100%（71/71），對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物多西環(huán)素的耐藥率為80.3%（57/71）。該研究中分離到的66 株奇異變形桿菌對(duì)紅霉素耐藥情況相似，對(duì)四環(huán)素類(lèi)耐藥性有差異，但總體上耐藥率較高，可能與樣品來(lái)源或區(qū)域不同有關(guān)。該研究中分離的奇異變形桿菌共66 株，數(shù)量相對(duì)較少，耐藥性分析結(jié)果不能全面反映奇異變形桿菌的耐藥情況，但從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)分析表明，奇異變形桿菌的總體耐藥性較為嚴(yán)重，需要相關(guān)部門(mén)多加關(guān)注。

有研究表明，新鮮雞肉中奇異變形桿菌的污染較為嚴(yán)重，存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，且奇異變形桿菌耐藥率較高。因此，首先要加強(qiáng)食品特別是生鮮肉類(lèi)食品中奇異變形桿菌的監(jiān)測(cè)，防止食品污染，減少食物中毒現(xiàn)象；其次要根據(jù)本地區(qū)奇異變形桿菌流行株引起的食物中毒菌株耐藥特征，選擇合理的藥物，減少盲目治療；最后建議消費(fèi)者學(xué)習(xí)健康知識(shí)，食物徹底加熱，防止交叉污染，提高食源性疾病的防范意識(shí)。