響應面法優化秦嶺黑木耳多糖提取工藝及抗氧化性研究

楊夢佳，韓曉江，王 濤，張 念

（商洛學院健康管理學院，陜西 商洛 726000）

0 引言

木耳（Auricularia auricula），又稱黑菜、桑耳、本菌、樹雞等，是一種藥食同源真菌，不僅可以食用，還可以作為藥用，營養豐富且具有很好的保健效果，被稱為“黑色瑰寶”和“人體的清道夫”[1-4]。其主要生理活性成分是木耳多糖，具有較強的抗氧化性[5]，還可以抗腫瘤[6]、抗潰瘍、抑菌[7]、抗衰老、降血糖[8]、降血脂[9]、提高機體免疫力，對人體組織有一定的保護作用。秦嶺山區之中，獨特的氣候條件生長出的黑木耳不僅作為“小木耳，大產業”助力脫貧致富，更賦予了該地區黑木耳獨特的口感、營養價值、生理活性等[10-11]。

通過熱水浸提輔助超聲波提取木耳多糖，經響應面優化最佳工藝得到提取木耳多糖的最佳工藝參數，同時對當地提取的木耳多糖進行抗氧化研究，為秦嶺地區黑木耳食物資源的開發利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陜西秦嶺特產柞水黑木耳；葡萄糖標準品，北京奧博星生物技術有限責任公司提供；苯酚（5%苯酚溶液）、濃硫酸、無水乙醇等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

DFY-500C 型搖擺式高速粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司產品；721 型可見光分光光度計，上海菁華科技有限公司產品；TD4-WS 型低速離心機、HH-S4 型四孔恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司產品；KQ3200DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 木耳多糖提取工藝

將從秦嶺深處柞水購買的黑木耳除去雜質，烘干后密封保存。

黑木耳→烘干→粉碎→熱水浸提（超聲輔助）→抽濾→濃縮→5%苯酚溶液→濃硫酸→蒸餾水定容→冷卻→測定。

1.3.2 單因素試驗

根據參考文獻[12-16]，結合試驗研究，最終確定超聲時間20 min，超聲溫度60 ℃，浸提溫度80 ℃，浸提時間60 min，研究料液比分別為1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80 時對多糖提取率的影響。

確定料液比為1∶60，超聲溫度為60℃，浸提時間為60 min，浸提溫度為80 ℃。同時，超聲時間單因素試驗條件定為10，20，30，40，50 min。

確定料液比為1∶60，浸提時間為60min，超聲時間為20min，浸提溫度為80℃。同時，超聲溫度分別設置為20，30，40，50，60 ℃。

確定料液比為1∶60，超聲時間為20 min，浸提時間為60 min，超聲溫度為60 ℃。同時，設置浸提溫度分別為50，60，70，80，90 ℃。

確定料液比為1∶60，超聲時間為20 min，浸提時間為60 min，超聲溫度為60 ℃。同時，設置浸提時間為 15，30，45，60，75 min。

1.3.3 響應面法優化

通過單因素試驗，確定了提取木耳多糖的最佳料液比為1∶60，最佳熱水浸提時間為80 ℃。利用響應面法設計試驗，試驗因素確定為超聲時間、超聲溫度、浸提時間。水平設置為三水平，超聲時間分別為40，50，60 min；超聲溫度分別為20，30，40 ℃；浸提時間設置為75，80，85 min。

1.3.4 多糖提取率計算公式

本試驗采用硫酸－苯酚法[17-18]測定多糖的含量。

式中：C——由標準曲線得到的木耳多糖的質量濃度，mg/mL；

V——定容后的體積，mL；

N——溶液最終的稀釋倍數；

m——木耳粉質量，g。

1.3.5 木耳多糖的抗氧化性

試驗采用體外方法1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼（DPPH 法） 測多糖的抗氧化性[19-20]。

配制DPPH 溶液。準確稱取0.8 mg 的DPPH 試劑，溶液用無水乙醇，溶解DPPH 試劑并定容至100 mL 的棕色容量瓶中，得到濃度為0.008 mmoL/L的DPPH 溶液，放入冰箱中避光保存。

取濃度為 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的木耳多糖溶液1 mL 放入具塞試管里，再加3 mL DPPH 溶液，避光反應20 min，用無水乙醇作空白，于波長517 nm 處測吸光度。

1.4 數據分析

單因素曲線采用Excel 處理，響應面使用Design Expert 11 軟件處理[21-22]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

由圖1 可知，木耳多糖的提取率隨著料液比的增加先增加后下降，最低提取率為22.29%時，料液比為1∶40；最高提取率為22.41%時，料液比為1∶60，極差是0.12%。經過料液比的單因素試驗，可以確定出在該試驗中提取秦嶺黑木耳多糖的最佳料液比為1∶60。

2.1.2 超聲時間對多糖提取率的影響

超聲時間對多糖提取率影響結果見圖2。

由圖2 可知，木耳多糖的提取率隨著超聲時間的增加呈上升趨勢，但在20～50 min 時多糖提取率的增加偏緩，只有在超聲時間由10 min 變為20 min時，多糖的提取率有顯著的提升，隨著超聲時間延長，可能會有其他雜質隨著多糖一起流入溶液中，影響多糖的測定。在不同超聲時間下，作為響應面法研究的影響木耳多糖提取率的單因素之一，以此確定最佳的超聲時間。

圖2 超聲時間對多糖提取率影響結果

2.1.3 超聲溫度對多糖提取率的影響

超聲溫度對多糖提取率影響結果見圖3。

圖3 超聲溫度對多糖提取率影響結果

由圖3 可知，超聲溫度為20～50 ℃時木耳多糖的提取率直線下降。超聲溫度為60 ℃時，木耳多糖的提取率又突然升高，這種現象的發生可能是因為超聲溫度越高，對細胞的破壞性就越大，細胞中的多種內容物就融入到了溶液中，導致測多糖溶液的吸光度突然升高。同時，考慮和其他因素的交互作用，選擇多糖提取率最高的3 個溫度進行響應面優化試驗，以此確定超聲溫度提取黑木耳多糖的最佳溫度。

2.1.4 浸提溫度對多糖提取率的影響

浸提溫度對多糖提取率影響結果見圖4。

圖4 浸提溫度對多糖提取率影響結果

由圖4 可知，浸提溫度為80 ℃時，木耳多糖的提取率達到最高，為23.64%。浸提溫度對多糖提取的影響趨勢有規律可循，選擇水提法的浸提最佳溫度為80 ℃。

2.1.5 浸提時間對多糖提取率的影響

浸提時間對多糖提取率影響結果見圖5。

圖5 浸提時間對多糖提取率影響結果

由圖5 可知，熱水提取黑木耳多糖時對黑木耳多糖的提取率影響很大，但沒有規律可循。當浸提時間為30～60 min 時，多糖提取率突然降低，當浸提時間為75 min 時，多糖提取率突然上升，不能確定隨著時間延長多糖得率變化趨勢，但浸提時間對多糖提取率極差在0.2%以內，考慮因素交互作用，選擇浸提時間作為響應面法因素進行優化。

2.2 響應面法試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗結果

響應面分析試驗設計表1。

表1 響應面分析試驗設計

通過單因素試驗，其中有2 個因素的試驗結果顯著，即料液比1∶60，提取溫度80℃，其余3 個因素超聲時間、超聲溫度和浸提時間有待進一步確定。單因素試驗結果表明，超聲時間在50 min 時，木耳多糖的提取率最高，所以在設計響應面試驗時，超聲時間設置為50 min 左右2 個水平，即40，50，60 min。超聲溫度和浸提時間水平選擇原理一樣，但由于超聲波清洗儀溫度設置太低容易受到室內溫度的影響，因此選擇超聲溫度為20，30，40 ℃。通過響應面法設計試驗，共設計17 組試驗。

響應面分析試驗設計見表2。

表2 響應面分析試驗設計

用Design Expert 11 軟件對試驗數據進行統計分析，得到以下回歸方程：

為了檢驗黑木耳多糖提取工藝的回歸模型有效性，對該模型進行檢驗和方差分析（見表3）。該回歸模型的p＜0.01，表明這個回歸模型極顯著，并且失擬項p=0.112 9＞0.05，表示不顯著，說明該模式成立。可以用該模式進行木耳多糖的最佳工藝優化。

方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果

2.2.2 響應面因素交互作用分析

任意兩因素之間的相互作用結果見圖6。

圖6 任意兩因素之間的相互作用結果

響應面的等高線顏色從藍變紅表示提取的物質含量由少到多，2 個因素的相互作用越大，等高線形成的形狀越趨近橢圓，離心率就越大。等高線所形成的橢圓越扁，則表明這2 個因素的交互作用越明顯。由圖6 可知，超聲時間和浸提時間相互作用的等高線形狀是橢圓形，說明這2 個因素的交互作用較大，超聲時間和超聲溫度的交互作用不是很明顯。木耳多糖的影響因素還可以通過觀察曲線的走勢來判斷。曲線的走勢越陡，說明該因素對木耳多糖的提取率越大，反之則越小。由圖6 可知，影響木耳多糖提取含量的重要因素是超聲溫度，其次是浸提時間，最后是超聲時間。這個結果和表3 一致。由響應面法回歸模型預測的木耳多糖的最佳提取工藝條件為超聲溫度26.813 ℃，浸提時間75.776 min，超聲時間50.856 min，最大的多糖提取率預測為25.302%。為了驗證試驗操作方便快捷，將響應面法模型優化的提取條件設置為整數，即超聲溫度26 ℃，浸提時間75 min，超聲時間50 min。在改變條件的情況下，進行3 次平行驗證試驗，3 次木耳多糖提取率的平均結果是24.95%，與模型預測的結果相差不大。因此，試驗模型可以較好地模擬和預測木耳多糖的浸提率和最優條件。

2.3 木耳多糖抗氧化性結果與分析

木耳多糖對DPPH 自由基清除率見圖7。

圖7 木耳多糖對DPPH 自由基清除率

由圖7 可知，木耳多糖有一定的抗氧化性，其抗氧化能力隨多糖含量的提高而提高，與現在有文獻的結論基本一致[23]。在木耳多糖質量濃度達到1 mg/mL 時，對自由基的清除率高達60.4%。木耳多糖的抗氧化性的發現和研究可以使木耳的銷路更好，使木耳的產業鏈更加完整，可將其加入到保健食品中，對緩解人體的衰老速度具有積極的意義。

3 結論

在單因素試驗的基礎上采用響應面法對木耳多糖的最佳提取工藝條件進行研究，響應面法回歸模型預測木耳多糖的最佳提取工藝條件為超聲時間50.856 min，超聲溫度26.813 ℃，浸提時間75.776 min，最大的多糖提取率預測為25.302%。為了驗證試驗操作方便快捷，將響應面法模型優化的提取條件設置為整數，即超聲溫度26 ℃，浸提時間75 min，超聲時間50 min，進行3 次平行驗證試驗，3 次木耳多糖提取率的平均結果為24.95%，與模型預測的結果相差不大。木耳多糖的抗氧化性采用DPPH 法對其進行測定，不同質量濃度的多糖溶液的抗氧化性不同，質量濃度越大，抗氧化性越強。當木耳多糖的質量濃度達到1 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率達到60.4%。