拉曼光譜技術在非侵入性優選卵裂期胚胎中的應用*

曹 芳，王宇峰，于春梅，夏西洋，高亭亭，戴秀亮

(南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院生殖中心，江蘇 常州 213000)

胚胎發育潛能直接影響人類輔助生殖技術的臨床結局。目前，主要以形態學評分評估胚胎質量，具有主觀性，預測妊娠結局的價值有限，因此，探索能更客觀地評價胚胎發育潛能，更準確地選擇優質胚胎，從而提高臨床妊娠率是胚胎學家需要攻克的難點。胚胎在其形態發生改變之前已發生了代謝產物的變化，而培養基是胚胎在體外的直接生存環境，培養基中代謝物質變化可能與胚胎質量有關。本研究探討了利用拉曼光譜技術對培養基代謝物質分析是否與胚胎生殖潛力相關，從而尋找一種新的客觀評價胚胎質量的方法。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2019年86例體外受精/卵細胞漿內單精子注射周期中第3天(D3)卵裂期胚胎培養液，其中D3優質卵裂胚形成優質囊胚27例，D3優質卵裂胚未形成囊胚29例，D3次級卵裂胚未形成囊胚30例。

1.2方法

1.2.1胚胎培養及分級 人絨毛膜促性腺激素日48 h后常規消毒取卵，在體外受精微滴中授精過夜，去除受精卵顆粒細胞后轉移至G1培養液滴，記錄第1天(D1)原核情況，D3將準備繼續進行囊胚培養的卵裂胚轉移至G2培養液滴。根據胚胎形態學評分標準對卵裂期胚胎進行分級，Ⅰ、Ⅱ級為優質卵裂胚；Ⅲ級為次級卵裂胚，Ⅳ級為廢棄胚胎。用序貫培養法將卵裂期胚胎繼續培養至第6天后根據卵裂胚繼續培養是否形成囊胚，以及形成的囊胚根據評分標準分為優質囊胚(內細胞團及滋養細胞均為B級以上)和次級囊胚(內細胞團或滋養細胞為C級)。

1.2.2檢測拉曼光譜數據 將保存在-80 ℃冰箱中的待測培養基樣品在25 ℃下解凍，平衡30 min，去除表面的礦物油，利用320 mW功率的拉曼光譜系統(Basecare Raman200，中國)收集拉曼光譜，激光波長785 nm，光斑大小為100 μm。取7 μL胚胎培養基滴落在覆蓋一層薄金膜(100 nm)的石英玻璃片上。在標準模式下單次檢測曝光時間為20 s，累計3次，最終拉曼信號通過電荷耦合器件相機收集、處理。

1.2.3拉曼光譜數據的處理與分析 獲取原始光譜后首先扣除暗電流貢獻的環境噪聲信號，再選取600～1 800 cm-1波段數據作為生物指紋區，然后進行基線校正去除部分由基底及背景熒光貢獻的干擾信號，采用主成分分析(PCA)，最后對所有樣本數據進行歸一化處理，統一數據規格。使用R軟件進行數據分析，使用ggplot2和ggpubur繪制分析結果。

2 結 果

86例卵裂胚培養液樣本中56例優質卵裂胚與30例次級卵裂胚之間的信號存在明顯差異，具有明確的聚類現象。見圖1。27例D3優質卵裂胚形成囊胚與30例 D3次級卵裂胚未形成囊胚之間的信號存在明顯差異，具有明確的聚類現象。見圖2。27例D3優質卵裂胚形成囊胚與29例D3優級卵裂胚未形成囊胚之間的信號存在明顯差異，具有明確的聚類現象。見圖3。分類準確性可達到85%以上。29例D3優質卵裂胚未形成囊胚與30例D3次質卵裂胚未形成囊胚之間的信號沒有明顯差異。見圖4。分類準確性只有57%。

圖1 優質卵裂胚與次級卵裂胚的信號PCA

圖2 優質卵裂胚形成囊胚與次級卵裂胚未形成囊胚的信號PCA

圖3 優質卵裂胚形成囊胚與優級卵裂胚未形成囊胚的信號PCA

圖4 優質卵裂胚未形成囊胚與次級卵裂胚未形成囊胚的信號PCA

3 討 論

目前，主要根據形態學(卵裂球數量、碎片、多核、空泡和卵裂球均一性)結合卵裂率(受精卵的卵裂速度)選擇卵裂期胚胎[1-2]。盡管這些評估系統對胚胎無損傷，操作簡便，但易受胚胎觀察人員主觀因素的影響，一定程度上制約了胚胎質量評估的可重復性。為選擇具有更高發育潛能的胚胎，胚胎學家建立了蛋白質組學、呼吸速率測量等[3-5]評估胚胎存活能力和發育潛力的非侵入性方法，但因檢測費用、技術人員培訓或不能快速提供結果等原因均未得到廣泛應用。氨基酸在早期胚胎發育中具有多種作用，其消耗和生產氨基酸的方式取決于發育階段。胚胎的細胞基因組在不同轉錄狀態下表達不同的蛋白分子，調控影響胚胎發育潛能[6-7]。有研究表明，不同發育時期胚胎分泌蛋白譜有著顯著的不同：在胚胎發育的最初24 h內培養液中分泌蛋白主要是母系來源蛋白；而D3胚胎由于合子基因組的激活，在培養液中產生大量的胚胎特異分泌蛋白。

拉曼光譜屬于散射光譜范疇，是光與物質相互作用而產生的。單色光入射到某一介質大多數產生瑞利散射；另有極少數散射光傳播方向及光波頻率發生了改變，這樣的散射被稱為拉曼散射[8]。有研究發現，通過不同材料的介質，由于散射層面的結構不同、分子基團對散射光頻率產生不同影響，從而可通過散射光特點對物質進行定性和定量分析[9-10]。由于拉曼光譜技術在物質檢測方面具有高效、簡便、樣本量少、重復性高等特點已被廣泛用于生物制藥、醫學檢驗等領域，成為疾病檢測和診斷的重要手段[11-13]。

不同發育潛力胚胎的培養液接受激光照射后會產生不同的拉曼光譜位移和譜帶強度。在輔助生殖技術領域中很少有學者使用拉曼光譜技術研究胚胎形態和胚胎質量之間的相關性。受精后胚胎應用單一培養法，每個微滴體積約25 μL，本研究利用拉曼光譜技術檢測樣本需求量極微，具有無創的特點，對傳統體外受精中的廢介質進行分析，通過胚胎培養液的變化快速優選胚胎。本研究對86例樣本分別進行9次不同點測試，共獲得774組樣本信號。為消除隨機誤差信號和宇宙高能離子對拉曼光譜信號的干擾，對每例樣本的9次重復信號進行合并、平均，共得到86例平均光譜組。其中56例優質胚胎與30例次級胚胎之間的信號存在明顯差異，具有顯著的分類聚合現象，且基于拉曼光譜技術的評估方法與體外受精過程中胚胎D3的形態學評分結果相一致。可能機制是發育至D3的優質胚胎和次級胚胎存在代謝差異，胚胎發育過程中不斷發生新陳代謝，通過自分泌作用改變周圍生存環境。29例優質卵裂胚未形成囊胚組及30例次級卵裂胚未形成囊胚組信號也存在明顯差異，具有明確的聚類現象，說明這種拉曼光譜之間的差異與囊胚形成能力無明顯相關。由于次級卵裂胚形成的囊胚數量較少，將在后續研究中比較優質卵裂胚形成囊胚及次級卵裂胚形成囊胚的差異，進一步證實卵裂期胚胎拉曼光譜是否與囊胚形成能力有關。

拉曼光譜學是基于分子振動信息，提供了豐富的分子結構和組成信息，而不造成任何損害[14-15]。另外，拉曼光譜學特別適用于水樣，而且該技術取材微量，檢測方便，本研究只用了幾分鐘和7 μL的樣本量檢測參數，為卵裂期胚胎提供了一種新的簡單、客觀、實時、無創的評估胚胎方法，結合形態學評估方法可更有效地選擇胚胎，也可用于評估不同培養基的培養效果、不同患者周期胚胎質量的比較等。尤其是對卵巢功能低下等獲卵少的患者，能更準確地在D3卵裂期利用拉曼光譜篩選出發育潛能優良的胚胎進行移植，縮短體外培養時間，提高卵子利用率，改善試管嬰兒的臨床妊娠結局并減少多胎妊娠。