LncRNA MEG3減輕缺血再灌注損傷所致腸黏膜屏障功能損害的機制*

黃賢偉，陳 波 ，藺際龑△

(廈門大學附屬第一醫院：1.急診科；2.檢驗科，福建 廈門 361000)

心臟驟停是致死率高的臨床常見危重癥[1]。缺血再灌注損傷(I/R)是心肺復蘇后患者突出的表現，目前研究已證實，心肺復蘇后患者存活率低下與多器官I/R密切相關[2]。其中腸黏膜I/R是影響整個病情發展的關鍵因素之一[3]。有效防治腸黏膜I/R是亟待解決的臨床問題。心臟驟停引起腸道的缺血缺氧，導致腸道黏膜屏障遭到破壞，腸黏膜通透性增強及功能喪失，免疫功能抑制、腸道菌群紊亂等病理改變，自主循環恢復后出現腸黏膜再灌注損傷，腸道中的微生物和內毒素可通過受損的腸黏膜屏障迅速進入體循環，引起網狀內皮系統發生系列反應，導致大量相關介質及細胞因子的激活與釋放，神經、體液、免疫系統、內分泌系統及血管活性物質等發生劇烈變化[4]，進而導致多器官功能障礙綜合征的發生，故腸黏膜I/R可成為機體“二次打擊的起源”，導致復蘇后患者病情惡化，甚至死亡[5]。當前研究表明，腸黏膜I/R與氧自由基損傷、鈣離子超載、炎性細胞因子大量浸潤、細胞大片凋亡、細胞因子釋放等密切相關,但具體發病機制目前仍不是很清楚。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)已被發現在多種生理和病理過程中發揮著重要作用[6]。有研究表明，LncRNA uc.173通過調節微小RNA-29b/claudin-1(CLDN1)信號調節腸道屏障功能[7]。有研究通過基因芯片檢測發現，肝臟I/R后LncRNA_AK139328表達上調，沉默LncRNA_AK139328表達可降低肝臟巨噬細胞水平和半胱氨酸蛋白酶-3活化水平，同時還降低了核因子κB活性，從而降低了炎性細胞因子的表達，對肝I/R產生保護作用[8]。LncRNA MEG3是一種廣為人知的LncRNA，在多種病理過程中發揮著不同的作用，包括癌癥進展和炎性反應[9-10]。在腦I/R的小鼠模型中已證實，LncRNA MEG3與神經功能障礙相關[11]。但LncRNA MEG3對腸黏膜I/R和腸黏膜屏障的影響尚鮮見相關文獻報道。本研究探討了LncRNA MEG3保護腸黏膜I/R后腸屏障功能的機制，旨在為腸黏膜I/R的治療提供潛在策略。

1 材料與方法

1.1實驗材料與儀器 人結直腸腺癌Caco-2細胞由美國紐約美國典型組織培養集合庫提供。10%胎牛血清購自美國Gibco公司，ADV4、ADV4MEG3、ADV1、ADV1MEG3、短發夾RNA(shRNA)載體均由中國南京Genscript公司合成。Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自Keygen Biot Solasodine公司。TRIzol購自美國Invitgen公司，第一鏈cDNA的合成按制造商(Invitgen，美國)說明書進行。定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(PCR)采用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ試劑盒(Takara，日本)，使用的引物序列：MEG3正向：5′-GTGAAGGTCGGAGTGAACG-3′，反向:5′- CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′；U6正向:5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′，反向:5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′；GAPDH正向:5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′，反向:5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′。Millicell ERS-2電阻系統購自美國默克-米利波爾公司。緊密連接蛋白(Occludin)和CLDN1、次級抗體購自中國Proteintech公司。日本尼康顯微鏡分析免疫熒光。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將細胞培養于含10%胎牛血清、鏈霉素0.1 mg/mL、青霉素100 U/mL的培養基中(37 ℃、5%二氧化碳)。建立體外缺氧缺糖(OGD)模型,Caco-2細胞在5%二氧化碳、1%氧和94%氮中孵育12 h，然后將細胞在常氧條件下培養6 h以實現復氧建立OGD模型。根據腺病毒載體裝載及其接受處理的不同，分為對照組、OGD組、OGD+ADV4組、OGD+MEG3組、OGD+ADV1組和OGD+shMEG3組。

1.2.2細胞存活率 采用CKK-8法檢測Caco-2細胞存活率。將約5×105個Caco-2細胞置于96孔板中培養12 h，然后加入含CKK-8培養基，繼續培養4 h，采用酶聯免疫吸附試驗微板閱讀器在450 nm處分析吸光度(OD)。

1.2.3細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒。收集大約1×106個細胞并用結合緩沖液洗滌。然后用FITC標記的Annexin V和PI在25 ℃時對細胞進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4LncRNA MEG3表達 提取總RNA。第一鏈cDNA的合成按制造商說明書進行。定量逆轉錄PCR采用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ試劑盒。

1.2.5腸屏障功能 測定腸組織跨皮細胞電阻(TEER)值分析腸屏障功能。TEER值檢測是評估腸黏膜屏障功能的重要指標[12-13]。將2×105個/mL Caco-2細胞覆蓋在膠原包裹的聚碳酸酯可穿透支持補充劑上。培養基每2天更換1次。使用Millicell ERS-2在3周時用TEER測量腸屏障。用4%多聚甲醛固定Caco-2細胞30 min，用Triton×100(0.2%)處理10 min，再用牛血清蛋白處理30 min。將載玻片與Occludin和CLDN1的抗體在4 ℃下孵育過夜，然后與次級抗體在37 ℃孵育1 h。在25 ℃下用Hoechst染色10 min。用尼康顯微鏡分析免疫熒光。

2 結 果

2.1各組細胞LncRNA MEG3表達水平比較 OGD組、OGD+ADV4組、OGD+MEG3組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組LncRNA MEG3表達水平與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；OGD+MEG3組LncRNA MEG3表達水平高于OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組及OGD+shMEG3組，OGD+shMEG3組LncRNA MEG3表達低于OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

與對照組比較，aP<0.01；與OGD+MEG3組比較，bP<0.01；與OGD+shMEG3組比較，cP<0.01。

2.2各組Caco-2細胞的細胞存活率比較 OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組Caco-2細胞的細胞存活率低于對照組，而OGD+MEG3組細胞存活率高于OGD+ADV4組與OGD組，OGD+shMEG3組細胞存活率低于OGD+ADV1組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

A.CKK-8法檢測細胞存活率圖(200×)；B.各組細胞存活率比較情況，與對照組比較，aP<0.01；與OGD+MEG3組比較，bP<0.01；與OGD+shMEG3組比較，cP<0.01。

2.3各組細胞凋亡情況比較 OGD組、OGD+ADV4組、OGD+MEG3組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組細胞凋亡高于對照組，OGD+MEG3組細胞凋亡低于OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組及OGD+shMEG3組，OGD+shMEG3組細胞凋亡高于OGD組、OGD+ADV4組及OGD+ADV1組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

A.流式細胞儀檢測細胞凋亡圖；B.各組細胞凋亡比較情況，與對照組比較，aP<0.01；與OGD+MEG3組比較，bP<0.01；與OGD+shMEG3組比較，cP<0.01。

2.4各組Caco-2細胞TEER值比較 OGD組、OGD+ADV4組、OGD+MEG3組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組Caco-2細胞的TEER值低于對照組，OGD+MEG3組TEER值高于OGD+ADV4組，OGD+shMEG3組TEER值低于OGD+ADV1組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖4A；作為對照的單層Caco-2細胞TEER值變化差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4B。

A.各組Caco-2細胞TEER值比較情況，與對照組比較，aP<0.01；與OGD+MEG3組比較，bP<0.01；與OGD+shMEG3組比較，cP<0.01；B.對照的單層Caco-2細胞TEER值。

2.5各組Caco-2細胞中緊密連接蛋白CLDN1和Occludin表達水平比較 免疫熒光顯示，OGD組、OGD+ADV4組、OGD+ADV1組、OGD+shMEG3組Caco-2細胞中CLDN1和Occludin的表達水平低于對照組；OGD+MEG3組過表達LncRNA MEG3可以減輕這種作用，但OGD+shMEG3組抑制LncRNA MEG3表達則增強這種作用。見圖5。

A.免疫熒光分析法檢測CLDN1表達水平(200×)；B.免疫熒光分析法檢測Occludin表達水平(200×)。

3 討 論

腸黏膜I/R是心肺復蘇患者救治的“瓶頸”之一，腸黏膜I/R可通過多種病理機制導致腸屏障功能障礙[14]，缺血損傷后腸道黏膜屏障遭到破壞，腸黏膜通透性增強及功能喪失，免疫功能抑制、腸道菌群紊亂等病理改變，自主循環恢復后出現腸黏膜再灌注損傷，腸道中的微生物和內毒素可通過受損的腸黏膜屏障迅速進入體循環造成患者病情惡化，當前缺乏有效治療手段。據文獻報道，核受體相關因子1通過抑制p21[15]促進I/R后腸道功能的恢復。LncRNA H19在腸黏膜I/R誘導的腸屏障功能障礙中具有保護作用[16]。LncRNA NEAT1可通過調節腸道屏障和外泌體介導的巨噬細胞極化抑制炎癥性腸病中的炎性反應[17]。LncRNA SPRY4-IT1通過調控連接蛋白[18]的表達調控腸黏膜屏障能力。

OGD模型是國內外研究I/R廣泛采用的離體模型[19]，LU等[20]在實驗中將Caco-2細胞經OGD處理模擬腸黏膜I/R。本研究預實驗發現將Caco-2細胞在5%二氧化碳、1%氧和94%氮中孵育12 h，然后將細胞在常氧條件下培養6 h實現復氧建立OGD模型，空白對照組與OGD處理后LncRNA MEG3表達調控各組比較，細胞存活及凋亡差異最顯著。有研究表明，腸黏膜I/R中細胞凋亡是其黏膜細胞主要死亡機制，本研究發現，LncRNA MEG3能減少OGD誘導的Caco-2細胞凋亡增加其存活率，因此考慮LncRNA MEG3可能通過減少細胞凋亡、維持腸黏膜的完整性，從而減輕損傷。

TEER值是反映腸黏膜屏障功能的可靠指標[21]。本研究結果顯示，OGD處理后Caco-2細胞TEER值顯著降低，LncRNA MEG3過表達明顯減輕OGD處理的Caco-2細胞TEER水平，進一步證明LncRNA MEG3能保護腸黏膜屏障功能。有研究已發現，Occludin和CLDN1是維持腸道屏障功能方面具有關鍵作用的蛋白[22]。本研究發現，OGD處理的Caco-2細胞中Occludin、CLDN1表達水平均明顯降低；而增加LncRNA MEG3表達后上述蛋白隨之升高，表明LncRNA MEG3在細胞實驗中能通過減少OGD處理的腸黏膜細胞凋亡增加維護腸黏膜的完整性，并通過增加Occludin、CLDN1表達維持腸道屏障功能，從而減輕I/R后腸黏膜屏障功能障礙。

綜上所述，LncRNA MEG3可能通過減少細胞凋亡并增加Occludin、CLDN1蛋白表達減輕I/R所致腸黏膜屏障損傷，保護腸黏膜的屏障功能，本研究這一發現能為腸黏膜I/R的治療提供潛在的新策略，但LncRNA MEG3能否在活體動物及人體內發揮同樣作用尚需進一步研究。