忍冬葉不同溶劑提取物與抗氧化的譜效關系研究

南敏倫，尹 涵，司學玲，張瀚水，林宇琪，馬春霞，趙昱瑋，赫玉芳*

（1.吉林省中醫藥科學院，長春 130012；2.吉林農業大學，長春 130118；3.修正藥業集團長春高新制藥有限公司，長春 130012；4.長春工業大學，長春 130021；5.長春中醫藥大學，長春 130117）

本研究采用高效液相色譜-串聯質譜（HPLCMS/MS）法，建立忍冬葉11種不同溶劑提取物的指紋圖譜，通過與對照品、文獻信息比對指認共有峰對應的化合物，再結合各提取物抗氧化活性，通過灰色關聯度法（GRA）和偏最小二乘法（PLS）聯合分析共有峰與抗氧化活性的譜效關系，旨在為忍冬葉抗氧化的藥效物質研究提供參考，為進一步開發忍冬葉提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100 series LC-MSD 型液質聯用儀，包括Agilent SL 型多級離子阱質譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測器（DAD）、Chemistation化學工作站等（美國Agilent公司）；QUINTIX35-1CN型十萬分之一電子天平（賽多利斯公司）；iMark型全自動酶標儀（美國BIO-RAD伯樂公司）；DR3900 臺式分光光度計（美國HACH）。

1.2 藥品與試劑

忍冬葉藥材（批號：210501）購自安國振國中藥材有限公司，經吉林省中醫藥科學院趙全成研究員鑒定其為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb）的干燥葉；馬錢苷、綠原酸、3,4-二羥基肉桂酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素對照品（批號分別為111640-201707、110753-201817、110885-201602、100080-201408、111720-201810、111521-201704、100081-201706、111520-201605，純度：≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 忍冬葉不同極性提取物制備

稱取忍冬葉藥材，分別用8倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇和蒸餾水，提取2次，每次1 h，濾過，分別合并提取液，濃縮，干燥，即得6種忍冬葉提取物，記為S1～S6。另稱取忍冬葉藥材，依次用8倍量95%乙醇、75%乙醇各提取2次，每次1 h，濾過，合并提取液，濃縮，加水至每毫升含2 mg藥材，再依次用石油醚（30～60 ℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇振搖提取，將上述4種濾液和振搖提取后的水相分別回收，干燥，即得5種忍冬葉提取物，記為S7～S11[1]。

2.2 忍冬葉提取物指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Alphasil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～15 min 7%A，15～50 min 7%A→ 25%A，50～ 70 min 25%A→ 35%A，70～ 90 min 35%A→ 55%A，90～ 95 min 55%A→7%A，95～100 min 7%A；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 質譜條件 以HESI為離子源；負離子檢測；掃描范圍為m/z 100～1 500；傳輸管溫度為350 ℃，輔助氣溫度為450 ℃；碰撞能量為30 eV；檢測方式為Full-MS/dd-MS2； dd-MS2分辨率為35 000。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取上述11種提取物，研細，各0.1 g，分別置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解，濾過，即得各供試品溶液。

2.2.4 對照品混合溶液的制備 分別精密稱取馬錢苷、綠原酸、3,4-二羥基肉桂酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素對照品適量，加甲醇制備成質量濃度分別為0.02、0.1、0.01、0.005、0.05、0.01、0.005、0.005 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.5 儀器精密度試驗 取70%忍冬葉乙醇提取物制備的供試品溶液（編號：S3），按色譜條件連續進樣測定6次，記錄20個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。以金絲桃苷色譜峰為參照峰，結果表明，相對保留時間的RSD均小于0.86%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于1.88%（n= 6），表明本儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取忍冬葉70%乙醇提取物制備的供試品溶液（編號：S3），按色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h時進樣測定，記錄20個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。以金絲桃苷色譜峰為參照峰，結果表明，相對保留時間的RSD均小于0.65%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于1.76%（n= 6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取忍冬葉70%乙醇提取物（編號：S3），共6份，制備得到6份供試品溶液，按色譜條件測定，記錄20個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。以金絲桃苷色譜峰為參照峰，結果表明，相對保留時間的RSD均小于0.59%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于1.76%（n= 6），表明該方法重復性良好。

2.2.8 指紋圖譜生成及特征峰確認 取“2.2.3”項下制備的11種忍冬葉提取物的供試品溶液，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件進行分析，得總離子流圖。將圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012年版）中，以 S3為參照圖譜，時間窗寬度為0.2 min，圖譜間距為20 mV，選擇中位數法，生成11種提取物指紋圖譜的共有模式見圖1，各共有峰峰面積見表1。根據各色譜峰的準分子離子峰、二級質譜碎片信息，并通過與對照品、化學成分數據庫、文獻信息[2-4]比對指認忍冬葉中的化學成分。結果，11種忍冬葉提取物中有共有峰20個，化學成分指認結果見表2。

表1 忍冬葉不同極性提取物共有峰蜂面積實驗結果

表2 忍冬葉提取物中化學成分的分析結果

圖1 11種忍冬葉提取物色譜峰共有模式圖

2.3 忍冬葉提取物抗氧化作用

2.3.1 DPPH 自由基清除率的測定 配制含DPPH 0.04 mg·mL-1的乙醇溶液和不同濃度忍冬葉各提取物溶液（0.05，0.1，0.25，1.0，2.0，4.0，8.0 mg·mL-1）。分別取不同濃度的各忍冬葉提取物溶液80 μL，分別加入200 μL 上述DPPH溶液，密閉、室溫、避光條件下反應 20 min后，在520 nm 下測定吸光值，以DPPH 溶液為空白對照組，按公式計算清除率： 清除率（%）=（1-實驗組OD值÷空白組OD值）×100%，試驗重復3次。以不同質量濃度各忍冬葉提取物濃度為橫坐標，清除率為縱坐標作圖，得到線性方程，計算其IC50值，以IC50值作為評價各忍冬葉提取物抗氧化強弱的指標[5]。

2.3.2 總還原能力的測定 取1.0 mL不同濃度的各忍冬葉提物溶液（0.5，1，2，4，8，12，16 mg·mL-1），依次加入pH = 6.6的0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液2.5 mL的和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，置50 ℃條件下保溫20 min 后置冰水中冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，離心（4 000 r·min-1）8 min，取5.0 mL上清液，依次加入去離子水 5.0 mL和0.1%三氯化鐵溶液1.0 mL，靜置10 min，以去離子水為空白對照，在700 nm 處測吸光值。試驗重復3次。以不同質量濃度各忍冬葉提取物濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得到線性方程，計算其IC50值[6]。

由表3結果顯示，在 0.05～8.0 mg·mL-1濃度范圍內，各忍冬葉提取物對 DPPH 自由基均具有清除作用，其中S9組的活性最強，其 IC50值為（1.08±0.15） mg·mL-1，活性最差的為S11組，其 IC50值為 （8.04±0.18） mg·mL-1；不同組別忍冬葉提取物隨濃度增加其清除自由基的能力也逐漸增強。由于抗氧化劑具有強的還原能力，可以將體內的三價鐵還原成二價鐵，增強血紅蛋白對氧的運輸能力，可以與自由基反應。在 0.5～16 mg·mL-1濃度范圍內，不同組別忍冬葉提取物均具有較強的還原能力，其中S9組的活性最強，其 IC50值為（3.41±0.10） mg·mL-1，活性最差的為S11組，其 IC50值為 （13.58±0.16） mg·mL-1；表明忍冬葉提取物可作為抗氧化劑提供電子，具有較強還原性。

表3 各組清除DPPH 自由基、還原能力的試驗結果

2.4 忍冬葉化學成分與抗氧化的譜效分析

2.4.1 GRA 利用DPS-3.01軟件，根據忍冬葉各提取物清除DPPH 自由基IC50及還原力IC50計算的活性數據，加權系數均為0.5。將各共有峰峰面積與抗氧化活性數據進行關聯。通過對數據進行標準化處理后，計算其關聯度，得到各峰對抗氧化活性的貢獻高低[7]。實驗結果表明，20個共有峰與抗氧化活性的關聯度均＞0.8，其排名前九位的共有峰分別為：峰5＞4＞16＞17＞18＞20＞19＞1＞9，見表4。

表4 忍冬葉提取物中20個共有峰與抗氧化的GRA分析結果

2.4.2 PLS 利用SIMCA-11軟件，經過多次提取主成分，多次迭代，擬合出20個共有峰對抗氧化的貢獻程度，計算標準化回歸系數[8-9]，見表5。

表5 忍冬葉提取物中20個共有峰與抗氧化活性的PLS分析結果

由表4結果可知，其各成分對抗氧化活性的貢獻程度與GRA的分析結果基本一致。除峰8、6、10、11呈負相關外，其余各峰均與抗氧化活性的回歸系數均大于0，成正相關，排名前九位的共有峰分別為：峰5＞4＞16＞18＞17＞19＞20＞1＞9，與GRA結果基本一致。

3 討論

據文獻[2]報道，忍冬葉中主要成分是酚酸類及黃酮類成分，此外還有少量的萜類、苷類、揮發油、生物堿等多種成分。由于化學成分類別的多樣性，提取方法也較多，通常情況下回流提取能有效的提取其中的化學成分，本研究選擇了回流提取法。不同類化學成分在不同極性溶劑中的溶解性具有明顯差異，揮發油易溶于石油醚中，生物堿溶于三氯甲烷中，酚酸類、黃酮苷元溶解于高濃度乙醇或乙酸乙酯中，黃酮苷、皂苷易溶解于低濃度乙醇或正丁醇中，多糖溶于水中，為了盡可能的將各類成分均提取出來，選擇了本研究中提取方法，提取得到了11種提取物。

對抗氧化活性實驗結果表明，11種忍冬葉提取物對 DPPH 自由基均具有清除作用，其中乙酸乙酯提取物的活性最強，其 IC50值為（1.08±0.15）mg·mL-1，活性最差的為經過不同溶劑萃取后的水提取物，其IC50值為（8.04±0.18）mg·mL-1；11種忍冬葉提取物隨濃度增加其清除自由基的能力也逐漸增強。11種忍冬葉提取物均具有較強的還原能力，其中乙酸乙酯提取物的活性最強，其 IC50值為（3.41±0.10）mg·mL-1，活性最差的為不同溶劑萃取后的水提取物，其 IC50值為（13.58±0.16）mg·mL-1，表明忍冬葉提取物可作為抗氧化劑提供電子，具有較強還原性。實驗結果表明其中乙酸乙酯提取物抗氧化作用最強。

本研究分析了忍冬葉11種提取物中20個化學成分，通過譜效分析確定了其中具有抗氧化活性的主要化學成分可能為峰 5、4、16、17、18、20、19、1、9，即3,4-二羥基肉桂酸、綠原酸、3,4-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草素、槲皮素、5-咖啡酰奎寧酸、4-咖啡酰奎寧酸，主要為酚酸類及黃酮類化合物，研究結果提示忍冬葉抗氧化活性可能與上述物質相關。由于酚類物質及黃酮類化合物含有一個或者多個酚羥基，這些酚羥基的存在使之具有良好的抗氧化活性[10]。盡管有文獻[11]報道忍冬中三萜類和多糖類成分亦具有一定的抗氧化活性，但與其中的酚類成分比較，抗氧化活性相對較弱。本研究印證了忍冬葉中抗氧化活性成分主要為酚酸類及黃酮類成分，同時明確了各成分抗氧化活性的強弱，對闡明忍冬葉抗氧化的藥效物質基礎，建立忍冬葉多指標質量控制標準具有明顯的積極意義，對于忍冬葉藥材的有效開發和利用具有重要的參考價值，對于天然抗氧化劑開發具有重要的理論參考和實際意義。