水產品中孔雀石綠質控樣品的制備和穩定性測試

馬瑞欣，周 凡，王曉靜，李雪萍，宋子瑾，張鵬燕

(1.河北省水產技術推廣總站，河北 石家莊 050035；2.河北省水產品質量檢驗監測站，河北 石家莊 050035)

實驗室質量控制是為了將分析測試結果的誤差控制在允許限度內所采取的控制措施，包括實驗室內質量控制和實驗室間質量控制。實驗室內質量控制是實驗室分析人員對測試過程進行自我控制，保證數據穩定性的重要措施；實驗室間質量控制，包括實驗室間比對和能力驗證，是發現和消除實驗室間存在的系統誤差，保證數據準確性的重要措施。實驗室質量控制的結果通過質控樣品的測試數據反映。

質控樣品是插入分析批中與檢測樣品一同經歷同樣檢測過程的樣品，實驗室可使用有證標準物質、采用特定方法準確賦值后的材料、實驗室在確認自身條件可靠的情況下得到準確含量或濃度的樣品作為質控樣品。質控樣品一般有兩種：一是在樣品中加入已知量的標準物質成為加標樣品；二是選用與被測樣品基體相同或相近的實物標準樣。

孔雀石綠(MG)是水產養殖中的禁用藥物，是水產品質量安全檢測中一個非常重要的參數。孔雀石綠在魚體內迅速代謝為隱色孔雀石綠(LMG)，隱色孔雀石綠消除緩慢，適宜作為監測孔雀石綠的標志物。在孔雀石綠檢測的質量控制中，不少檢測人員遇到了回收率不滿意的結果。本文探討孔雀石綠及隱色孔雀石綠質控樣品的兩種制備方法，并測試了質控樣品的穩定性，以期對孔雀石綠實驗室內質量控制和實驗室間質量控制提供幫助。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與材料

LC-20AD液相色譜儀(日本島津)、QTRAP 4500 三重四極桿質譜儀(美國AB SCIEX)、JR06C-200碎肉機(蘇泊爾)。

草魚/鯉冷凍肉糜，草魚/鯉鮮肉糜，新鮮草魚、鯉和羅非魚。

1.2 試樣制備

1.2.1 加標樣品 選用未檢出的草魚肉糜和鯉肉糜樣品，每個樣品分別稱量3份，每份5.00 g，加入MG和LMG各10 ng，渦旋混勻，制備成平行樣品。冷凍肉糜加標樣品在加標第1天、第3天和第5天測定其回收率。第1天的測試在放置30 min后檢測，第3天和第5天的測試樣品-20 ℃保存，測試前取出室溫解凍后檢測。冷凍草魚肉糜加標樣品共測試45個，冷凍鯉肉糜加標樣品共測試50個。新鮮或冷鮮草魚和鯉在加標后的第2天、第4天、第6天進行測試，新鮮草魚共測試34個，新鮮鯉共測試42個。

1.2.2 實物樣品 取鮮魚類的脊背肉，切成5～6 cm肉塊，分別用MG 100 μg/L的水溶液和LMG 100 μg/L的水溶液浸泡草魚、鯉和羅非魚的肌肉，MG和LMG溶液的用量按溶液的體積(mL)與魚肉質量(g)比為1∶1使用，浸泡時間分別為1、2 h和4 h，之后取出，用吸水紙吸干表面水溶液，切成小塊，混勻，絞成肉糜，-20 ℃保存待用。

1.3 檢測方法

采用GB/T 19857-2005中的液相色譜-串聯質譜法。

2 結果與討論

2.1 加標樣品

2.1.1 冷凍肉糜加標樣品 冷凍草魚肉糜加標樣品測試回收率結果見圖1；冷凍鯉肉糜加標樣品測試回收率結果見圖2。回收率70%～120%為合格，不合格的數量占比見表1。

圖1 冷凍草魚樣品加標回收測試結果

圖2 冷凍鯉樣品的加標回收測試結果

表1 回收率不合格統計表 %

綜合分析上述圖表可以看出：(1)不論是草魚還是鯉，LMG或者保持回收率穩定，或者回收率呈現連續下降趨勢；而MG或者保持回收率穩定，或者回收率呈現波動狀態。說明實驗室間質量控制宜選擇LMG作為測試參數，不宜選擇MG作為測試參數。(2)選用冷凍樣品制備LMG加標質控樣，鯉樣品的回收率及穩定性優于草魚樣品。

2.1.2 鮮肉糜加標樣品 鮮草魚肉糜加標樣品回收率測試結果見圖3，鮮鯉肉糜加標樣品回收率測試結果見圖4。

圖3 鮮草魚樣品加標回收測試結果

圖4 鮮鯉樣品加標回收測試結果

鮮草魚34個樣品中有2個樣品LMG回收率低于70%；鮮鯉42個樣品LMG回收率全部滿足要求。兩組樣品MG的回收率出現較大波動，特別是草魚的C1-C4和鯉的L4-L19出現第一次回收率偏低，第二次或第三次回收率偏高，是因為在測試過程中發現內標加入后放置時間的長短對MG檢測結果的影響很大而對LMG沒有影響，后經實驗進行了證實，因此草魚的C5-C34和鯉的L20-L42注意控制了內標加入后放置時間保持比較一致，數據能夠反應樣品的回收率和穩定性。從C5-C34和L20-L42數據分析可知，MG的穩定性和回收率仍不及LMG，但經過篩選也可以找到適合做實驗室內部質量控制和實驗室間質量控制的合適樣品，且鯉滿足要求的幾率比草魚大。建議在選擇MG作為實驗室間質量控制的測試參數時，應在作業指導書中明確要求加入內標后的放置時間，否則MG檢測結果無法評定。圖5是某次能力驗證中MG和LMG 的測試結果，共計38家單位參加測試，LMG回收率在70%～120%范圍的有31家，MG只有14家，且數據分散性很大。

圖5 能力驗證中MG和LMG測試結果

分析鮮魚糜加標樣品的測試結果可知：鮮草魚和鮮鯉魚加標樣品的穩定性較冷凍草魚和冷凍鯉加標樣品的穩定性好，鮮鯉加標樣品的穩定性更好。鮮魚糜加標樣品的 MG穩定性和回收率不及LMG，宜選擇LMG作為實驗室間質控測試參數。選擇MG作為實驗室間測試參數時，應明確要求加入內標后的放置時間。

綜合分析加標樣品的測試結果可以看出：樣品的個體差異是導致MG和LMG檢測值出現較大變化的主要原因，MG和LMG檢測值的變化并非二者之間的轉化，可能是發生了降解反應。

2.2 實物樣品

實物樣品在一段時間內的穩定性檢測結果見圖6和圖7。

圖6 孔雀石綠水溶液(100 μg/L)浸泡的樣品檢測結果

圖7 隱色孔雀石綠水溶液(100 μg/L)浸泡的樣品檢測結果

由圖6分析得知：用MG水溶液浸泡后，都可以檢出LMG，羅非魚轉化最顯著，鯉次之，草魚最少。由圖7分析得知：用LMG水溶液浸泡后，草魚和鯉中未檢出MG，而羅非魚中可以檢出少量的MG。浸泡時間越長，含量越高。

Plakas等和Srivastava等認為，MG在溶液中與氫氧根離子結合生成非離子化的、無色的醇的形式(carbinol form)，脂溶性更強，更利于通過細胞膜進入細胞并部分進行代謝；而LMG結構類似于芳香胺，其通過細胞膜進入細胞的能力較弱。所以用MG水溶液浸泡后檢測值較高，且能檢測到LMG；而用LMG浸泡后檢測值較低。

由圖6和圖7可知：不同種類的魚肌肉中MG和LMG的含量和轉化情況均不相同。MG含量波動較大，而LMG含量穩定性較好，可以用LMG作為實驗室間質量控制的測試參數。按上述方法制備了鯉肌肉LMG能力驗證樣品，浸泡時間為1 h，測試結果按z比分數進行判定，||≤2，表明“滿意”，無需采取進一步措施；2<||<3，表明有“問題”，產生警戒信號；||≥3，表明“不滿意”，產生措施信號。圖8為用標準四分位距法做的Z值分布圖，共24家單位參加測試，樣品測試平均值4.56 μg/kg。其中22家結果滿意，1家有“問題”，1家結果不滿意。

圖8 LMG實物樣品能力驗證結果Z值分布圖

3 結論

通過實驗比較和實際運用，可以得出以下結論：(1)兩種質控樣品的制備方式均表明孔雀石綠檢測值穩定性比隱色孔雀石綠差，如進行實驗室間能力驗證，由于時限較長，建議選擇隱色孔雀石綠作為測試參數。(2)選擇加標樣做為質控樣時，宜選用未檢出的鮮肉糜；選擇實物樣品作為質控樣時，應注意樣品品種、藥物濃度、藥浴時間、藥物轉化等問題。(3)進行加標質控樣品的制備時，應考慮樣品的品種和個體差異。就鯉和草魚而言，鯉較適宜。(4)加標樣可以保證平行樣檢測數據良好的精密度，實物樣品在制成肉糜的過程中，由于肉類的黏性較大，均勻性較難保證完全一致，導致檢測結果的復現性較差些，見圖6。可以通過制成凍干粉使得均勻性得到改善，但制備成本會增加。(5)肉糜中不存在MG和LMG的相互轉化，鮮肌肉塊中存在二者的相互轉化，可能是由于二者的轉化是在細胞內完成所致。