一例豬副豬嗜血桿菌病的診斷

吳 芳 福建省漳州市龍海區(qū)隆教畜牧獸醫(yī)站 福建 漳州 363100

副豬嗜血桿菌病又稱格拉澤氏病或革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）引起。該病臨床上以體溫升高、四肢腫脹、呼吸困難、纖維素性多發(fā)性炎癥和高病死率為特征[1]。HPS是一種非溶血性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型、兼性厭氧、無芽孢的革蘭氏陰性短小桿菌[2]。HPS只感染豬，臨床上2周～4月齡豬均可感染，發(fā)病率可達40%，病死率可達50%[3]。現(xiàn)將一例副豬嗜血桿菌病的診斷情況報道如下。

1 發(fā)病情況

2019年3月，連續(xù)陰雨，氣溫驟降。福建省某養(yǎng)殖場的12棟保育舍（每棟飼養(yǎng)600頭斷乳仔豬），飼養(yǎng)員關閉卷簾對豬群進行保溫，使得保育舍白天夜晚均處于密閉狀態(tài)。室內溫度高于室外溫度，空氣不流通并且潮濕。3周齡～2月齡保育仔豬表現(xiàn)為飲食欲不振、精神沉郁、耳朵發(fā)紫、行走緩慢、不愿站立，較為嚴重的患豬關節(jié)腫脹、跛行。

2 臨床癥狀

發(fā)病初期，仔豬表現(xiàn)為短促咳嗽，體溫達40.5～42℃，精神沉郁，食欲不振，畏寒擠臥。中期，仔豬喘氣加劇，呼吸急促，眼瞼水腫，鼻孔流膿性分泌物；患豬后肢關節(jié)腫脹，行走困難，無法站立，呈“犬”坐姿，甚至癱瘓；患豬扎堆而睡；部分患豬皮膚潮紅，耳尖發(fā)紺。后期，患豬表現(xiàn)為飲食欲廢絕，逐漸消瘦；皮膚蒼白，被毛粗亂；呼吸困難，四肢腫脹，共濟失調，最終死亡。

3 剖檢病變

剖檢患豬，發(fā)現(xiàn)頜下淋巴結和腹股溝淋巴結均出血腫大；胸腔內有大量積水；心臟表面有一層絨毛樣被膜覆蓋；打開腹腔見大量纖維素性滲出物附著于腸黏膜和肝、脾等組織器官表面，呈淡黃色條索狀；肝瘀血腫大；肺臟腫脹并瘀血，觸之有實變；胃潰瘍；腦膜充血水腫；切開關節(jié)腫脹處有膠凍樣物流出。

4 實驗室檢查

4.1 細菌分離培養(yǎng) 無菌采集疑似患豬的肺臟、氣管、關節(jié)積液，接種于含NAD和5%犢牛血清的TSA平板以及無NAD的TSA平板上，置37℃培養(yǎng)24～48 h（病原菌送至省農(nóng)科院檢測，已經(jīng)排除有其他病原共感染）。結果在含NAD和5%犢牛血清的TSA平板中可觀察到圓形、光滑濕潤、無色透明的菌落；無NAD的TSA平板上沒有菌落生長。

4.2 細菌培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察 挑取單個菌落分別劃線接種5%新生犢牛血清TSA固體培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中燭缸厭氧培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況。結果分離菌在麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基中均未見生長；在兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長差，只有極少數(shù)菌落生長；在巧克力瓊脂平板、5%新生犢牛血清TSA固體培養(yǎng)基中生長最好，可見大量光滑濕潤、無色透明的菌落生長。

4.3 涂片染色鏡檢 挑取部分菌落均勻涂布于滴有生理鹽水的載玻片上。固定載玻片后，革蘭氏染色，鏡檢[4]。可觀察到革蘭氏陰性細小桿菌，無芽孢，個別菌株呈兩極濃染的球桿狀。

4.4 生化試驗 細菌純化培養(yǎng)后，分別接種系列生化培養(yǎng)基，置37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，結果分離株對NAD依賴性、接觸酶、丙二鹽、葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、枸櫞糖、D-核糖、果糖、山梨醇、木糖呈現(xiàn)陽性；對溶血性、尿酶、硫化氫、硝酸鹽、吲哚呈現(xiàn)陰性。

4.5 PCR鑒定 將純化好的菌株接種到TSB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。取1 mL混合液放入1.5 mL離心管中，煮沸15 min，在20 μL反應體系中10×buffer 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、rTaq酶0.2 μL、20 mmol/L上游引物P1和下游引物P2（參照Simone Oliveira等[5]發(fā)表的報告中的合成引物：P1（5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′）、P2（5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′））各0.5 μL、模 板2.0 μL、滅菌雙蒸水13.2 μL。在滅菌EP管中依次加入以上試劑，離心混勻。經(jīng)過94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min進行擴增。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果在紫外凝膠成像系統(tǒng)中可觀察到一條約在800 bp的特異性條帶，其大小與預期的擴增片段大小相符（見圖1）。

圖1 分離菌的PCR鑒定結果

5 小結與討論

1）根據(jù)患豬的臨床癥狀、病理剖檢，再結合培養(yǎng)的分離菌株的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化特性，初步鑒定該分離菌為HPS。用HPS序列設計引物進行PCR擴增，結果獲得一條符合該病菌的特異性條帶。經(jīng)過上述檢查，確診該病為副豬嗜血桿菌病。

2）HPS感染在臨床上很容易與傳染性胸膜肺炎、豬偽狂犬病以及豬瘟等發(fā)生共感染，導致豬群病死率高達90%[6]。此外，該病的臨床癥狀、剖檢病變與豬鏈球菌病極其相似。副豬嗜血桿菌病常表現(xiàn)關節(jié)腫痛、跛行和共濟失調等，常會被誤診為豬鏈球菌病。然而兩種疫病不同的是，HPS感染具有皮膚潮紅、耳朵發(fā)紺癥狀，患豬的關節(jié)面有漿液，為纖維素性化膿性炎癥，潤滑液增多；而豬鏈球菌病不會出現(xiàn)副豬嗜血桿菌病的典型癥狀，大多呈化膿性關節(jié)炎，觸摸為硬的實性炎癥。

3）目前，副豬嗜血桿菌病經(jīng)常繼發(fā)于其他病毒性疾病，在實際生產(chǎn)中，較大一部分管理者會將重心放在治療其他病毒性疫病上，而忽視該病的防控與治療，最終使得較多的豬只免疫力下降，最終死亡于此類細菌性疫病。又因為HPS有多種血清型，臨床上很難針對某一血清型研發(fā)疫苗預防該病。副豬嗜血桿菌病發(fā)生主要與各種應激有關。在集約化養(yǎng)殖模式下，部分養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖理念還是未能跟上科學養(yǎng)豬的要求，導致飼養(yǎng)管理上的不足，比如用過的針頭、注射器隨處擺放；多頭患豬共用1個針頭；豬群斷乳轉群時，為爭奪領地互相打斗，傷口往往會被忽視，細菌容易從傷口進入豬只機體中，引起細菌性疫病；此外豬舍消毒不完全，清洗后未晾干，飼料潮濕等應激因素，也增加豬群患該病的幾率。

4）大量臨床資料表明，完善病毒性疫病的免疫防控和合理應用藥物防治可明顯降低該病的發(fā)病率和病死率。防控措施主要有以下幾個方面：（1）在豬群中發(fā)現(xiàn)疑似該病的臨床癥狀時，應結合相關的技術確診，及時治療。（2）減少應激。（3）定期消毒，徹底清理豬舍衛(wèi)生。防治該病還是要做到“養(yǎng)防結合”，加強豬群的飼養(yǎng)管理，營造舒適的環(huán)境，這樣既可以減少不必要的死亡與經(jīng)濟損失，也能使豬群健康成長。