基于Nrf2通路研究通腑養髓方調控Wilson病模型TX小鼠神經細胞鐵死亡的機制

李東昇，程 楠，董健健，徐陳陳，耿 昊，高曼莉

(1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學神經病學研究所附屬醫院，安徽 合肥 230061)

Wilson病(Wilson’s disease, WD)是一種由ATP7B基因突變導致的常染色體隱性遺傳銅代謝障礙性疾病，是神經遺傳病領域重點防治的疾病[1]。前期臨床研究[2]發現，腦型WD患者(尤其是出現嚴重運動障礙和病程較長的難治性腦型WD患者)常規驅銅治療的療效差，病情康復緩慢，生活質量和學習、工作能力明顯下降，嚴重者甚至危及生命。因此，研究WD神經細胞的損傷機制及治療策略對改善腦型WD患者的病情和預后有重要意義。

基于WD診療的臨床需求，安徽中醫藥大學神經病學研究所根據腦型WD患者的中醫辨證研究結果，創用通腑養髓方治療腦型WD患者獲得顯著療效[3]。實驗研究[4-6]發現，通腑養髓方可調控凋亡、自噬相關信號通路，起到改善突觸功能障礙，減輕神經細胞損傷的治療效果。此外，已有研究資料證實，除了銅蓄積直接導致神經細胞損傷外，ATP7B基因突變引起銅藍蛋白(ceruloplasmin, CP)合成障礙和亞鐵氧化酶活性減低致細胞內鐵穩態失衡是難治性腦型WD神經細胞損傷的重要機制，也是這些患者常規驅銅療效不佳的主要原因。近年來研究發現，一種鐵依賴性非程序性細胞死亡方式(鐵死亡)與多種神經遺傳變性病的發病關系密切，且與腦型WD的神經細胞損傷機制相契合[7]。近期研究[8]發現，抗核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2- related factor,Nrf2)信號通路是鐵死亡的一個重要調控通路，激活該通路能阻斷ferrostatin-1等鐵死亡誘導劑誘導的鐵死亡而具有細胞保護作用，是難治性腦型WD神經細胞損傷的潛在治療靶點。基于此，本研究基于Nrf2信號通路觀察通腑養髓方對WD模型TX小鼠神經細胞鐵死亡的干預效應，并探討通腑養髓方對WD神經細胞損傷的保護機制。

1 材料

1.1 實驗動物 WD模型TX小鼠種鼠及其正常對照組DL小鼠，均從美國Jackson實驗室中心引進，于中國科學院合肥物質研究院SPF級實驗動物中心繁殖培育。對每只DL小鼠及TX小鼠均進行基因檢測，對DL純合及TX純合小鼠分別進行合籠繁殖處理。實驗動物使用許可證號：SYXK(皖)2018-005，實驗動物合格證號：3198342；本研究經中國科學院合肥物質科學研究院動物倫理委員會批準(編號 IACUC19001)。

1.2 主要試劑和藥品 參照安徽中醫藥大學神經病學研究所研制的通腑養髓方組方[9]，藥物組成及劑量：大黃、黃連、莪術、姜黃、芍藥各30 g，魚腥草45 g，澤瀉36 g，三七4.5 g，山茱萸40 g。加入蒸餾水 2 000 mL，浸泡 30 min，大火煮沸后加入大黃，再以文火煎30 min，過濾至燒杯中，藥渣再加入蒸餾水2 000 mL，重復煎煮過濾。將2次藥液合并，文火濃縮至1 500 mL(含生藥0.184 g/mL)，冷卻后倒入棕色瓶內，并于4 ℃冰箱保存備用。抗TfR抗體(ab185550)、抗谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)抗體(ab125066)、Nrf2抗體(ab62352)、抗鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain,FTH1)抗體(ab183781)、抗血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO1)抗體(ab52947)、抗醌氧化還原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)抗體(ab80588)：英國Abcam公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器與設備 CK2型熒光倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司；XTZ-D型解剖顯微鏡：上海光學儀器一廠；BioTek Epoch2型全波長酶標儀：美國Biotek公司；NexION 350D型電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)儀：美國PerkinElmer公司；Fine DO X6 型全自動化學發光圖像分析系統：上海天能科技有限公司；TGL-16型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗儀器開發有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組 按照文獻[9]方法復制動物模型和給藥。以DL小鼠為正常對照組(n=30，9.0 g/L氯化鈉注射液)；將TX小鼠(n=60)隨機分為2組：模型組(n=30，9.0 g/L氯化鈉注射液)、通腑養髓方組(n=30，20 g/kg通腑養髓方溶液)。將各組小鼠適應性飼養3 d后，每日同一時間段給予藥物或9.0 g/L氯化鈉注射液灌胃，連續30 d，給藥結束后，使用1%戊巴比妥鈉麻醉后處死各組小鼠，完整分離小鼠腦組織。

2.2 ICP-MS法檢測各組小鼠腦內銅、鐵微量元素含量 樣品消化分解：根據實驗分組收集各組腦組織(n=6)，每管加入1 mL含95%的濃硝酸，100 ℃金屬浴60 min，直至管內組織完全消化分解，管內液體呈澄清透明即可，4 ℃放置待測。建立標準曲線：使用調諧液調整射頻功率、氣體流量、標準度、掃描時間和次數等儀器參數。稀釋標準曲線溶液，濃度由低到高，空白管為雙蒸水，每管復測3次，根據空白管和對照管數值，建立標準曲線。上機檢測：稀釋各組樣品，依次上機檢測(復測3次)，并做好分組標記，將所得數值代入建好的標準曲線，根據公式、樣品質量和樣品稀釋倍數計算出樣品中銅、鐵微量元素的含量。

2.3 免疫熒光技術檢測TX小鼠腦內TfR表達水平 使用冰凍切片機對小鼠腦組織進行切片，選擇最大橫截面，厚度為35 mm，然后將腦片放置于盛有PBS的24孔板中，4 ℃保存。取腦片放置于反應皿中，0.3% Triton X-100室溫反應15 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌，山羊血清原液37 ℃反應30 min，加入抗TfR抗體，4 ℃過夜，PBS洗滌，加入二抗反應30 min，PBS洗滌，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色細胞核，貼片，晾干，封片，曝光。熒光顯微鏡下TfR陽性呈現為紅色，采集圖像后經Image J軟件進行定量分析。

2.4 TX小鼠腦組織中SOD活性、MDA含量測定 用硫代巴比妥酸法測定腦組織勻漿中MDA水平，可溶性噻唑鹽(WST-8)法測定腦組織勻漿中SOD活力。

2.5 透射電子顯微鏡下觀察線粒體結構 使用冰凍切片機對小鼠腦組織進行切片，加入1 mL電子顯微鏡固定液，室溫固定2 h，再轉移至4 ℃冰箱過夜。經脫水、干燥、粘樣后通過透射電子顯微鏡觀察細胞內線粒體結構。

2.6 Fluoro-Jade B(FJB)染色觀察小鼠神經細胞損傷程度 使用冰凍切片機對小鼠腦組織進行切片，經過浸泡、反應、漂洗后均勻滴加0.000 4% FJB染液，處理后浸泡在熒光顯微鏡下。變性神經細胞在鏡下會呈現綠色熒光，采集圖像后經Image J軟件進行定量分析。

2.7 Western blot法檢測TX小鼠腦鐵死亡及Nrf2通路相關蛋白(GPX4、Nrf2、FTH1、HO-1、NQO1 )表達水平 各組取腦組織100 mg切碎，加入裂解液和蛋白酶抑制劑混合，用研磨機研磨至無絮狀沉淀，靜置30 min后離心，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度，加適量的蛋白上樣緩沖液，再通過電泳、轉膜、封閉、一抗過夜，二抗孵育2 h，顯影劑中浸泡，顯影后用Image J軟件采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值。

3 結果

3.1 通腑養髓方對TX小鼠腦內銅、鐵微量元素含量的影響 與正常對照組比較，模型組TX小鼠腦內銅、鐵含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，通腑養髓方組TX小鼠腦內鐵含量顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養髓方組；

3.2 3組小鼠TfR表達水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠TfR表達水平顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，通腑養髓方組TfR表達水平顯著減少(P<0.05)。見圖2。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 3組小鼠腦內SOD活性、MDA含量比較 與正常對照組比較，模型組小鼠腦內SOD活性顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，通腑養髓方組小鼠腦內SOD活性顯著上升(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。見圖3。

3.4 透射電子顯微鏡觀察各組小鼠腦組織細胞線粒體形態 正常對照組小鼠腦組織細胞線粒體結構正常；模型組小鼠腦組織細胞線粒體膜皺縮，嵴數量減少或消失，出現空泡；通腑養髓方組與模型組比較，線粒體膜平滑，嵴數量增加，損傷程度減輕。見圖4。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.5 3組小鼠腦皮質神經細胞損傷程度比較 模型組小鼠腦皮質神經細胞損傷程度較正常對照組顯著增加(P<0.05)；通腑養髓方組腦皮質神經細胞損傷程度較模型組顯著減少(P<0.05)。見圖5。

3.6 3組小鼠腦內GPX4表達水平比較 與正常對照組比較，模型組GPX4蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，通腑養髓方組GPX4蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖6。

3.7 3組小鼠腦內Nrf2通路相關蛋白表達水平比較 與正常對照組比較，模型組Nrf2、FTH1、HO1、NQO1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，通腑養髓方組Nrf2、FTH1、HO1、NQO1蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖7。

圖4 透射電子顯微鏡觀察各組小鼠腦組織細胞線粒體形態(3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，1×4 000倍，1×8 000倍)

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.正常對照組；B.模型組；C.通腑養髓方組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

鐵死亡是Dixon[7]在2012年發現的一種程序性細胞死亡方式，不依賴于經典細胞凋亡通路的調控，不受凋亡、壞死和自噬的影響，其本質是鐵離子依賴的脂質過氧化產物超量蓄積引起氧化損傷，最終導致細胞死亡[10]。近期一項應用免疫熒光染色檢測神經細胞鐵死亡的研究[11]發現，發生鐵死亡的神經細胞TfR表達水平增加、MDA水平升高，提示這兩個指標是反映神經細胞鐵死亡的特異性指標。另有研究[12]發現，GPX4失活可誘導細胞發生鐵死亡,是反映鐵死亡的重要指標。本研究發現，WD模型TX小鼠體內銅、鐵等微量元素高于正常對照組，證明其腦組織內不但存在銅的蓄積，還存在鐵的異常沉積。免疫熒光檢測結果顯示，TX小鼠腦組織的TfR含量明顯高于正常對照組，且TX小鼠腦組織的SOD活性顯著下降，MDA水平顯著升高，GPX4蛋白表達水平顯著降低。透射電子顯微鏡觀察結果顯示，TX小鼠腦組織線粒體出現線粒體膜皺縮、嵴數量減少或消失、空泡產生等典型的鐵死亡形態。因此，本研究首次發現WD模型TX小鼠腦內存在鐵死亡效應。

本課題組前期根據中醫“毒損絡脈”理論，將WD分為毒伏肝絡期、毒損肝絡期、肝絡瘀阻期、毒邪逆傳期4個中醫病機分期，以及痰濕阻絡、肝膽濕熱、痰瘀互結、痰火擾心等12個證型[13]。針對四肢震顫、筋脈拘急、五心煩熱盜汗、腰膝酸軟、精神異常的部分腦型WD患者，本課題組從中醫經典理論“久病致瘀”以及WD患者本身先天稟賦不足的證候特點出發，在肝豆湯的基礎上加用三七、山茱萸等活血養髓中藥組成“通腑養髓方”，以達到通腑養髓的目的。研究發現，以“通腑養髓”為治療目的的肝豆湯改良方可通過促進過量銅排出而抑制神經細胞內CytC、Caspase-3和Caspase-9的表達，從而減輕銅過量對神經細胞的損傷作用[14]。肝豆湯改良方通過上調XIAP蛋白及其mRNA的表達水平，下調Caspase-9、Caspase-3蛋白及其mRNA在腦組織中表達水平，減輕銅沉積對神經細胞的氧化應激損傷，從而抑制神經細胞的凋亡[4]。而通腑養髓方可通過調節自噬相關蛋白表達水平，調控LKB1-AMPK信號通路，抑制自噬的發生，從而阻斷高銅誘導的神經細胞損傷，并有效發揮神經保護作用[15]。本研究發現，通腑養髓方可降低WD模型TX小鼠腦內鐵含量，提高SOD活性，降低MDA水平，減輕神經細胞損傷，上調GPX4蛋白表達水平。結果表明，通腑養髓方可有效減輕體內銅、鐵沉積造成的神經細胞損傷，降低體內氧化應激水平，具有保護作用。

Nrf2是抗氧化防御系統的重要轉錄因子，可以抵抗內部和外部的氧化以及化學刺激[16]。Shind等[17]研究發現，Nrf2通路能改善氧化應激，在抑制鐵死亡過程中發揮重要作用，當受到ROS或親電試劑的刺激時，Nrf2會轉移入細胞核內，與靶基因促進區域的抗氧化反應元件(ARE)相互作用，啟動下游抗氧化蛋白基因FTH1、HO-1、NQO1等的轉錄，提高細胞抗氧化能力，維持細胞氧化平衡，從而影響鐵死亡[18-19]。本實驗結果表明，模型組TX小鼠腦內Nrf2通路相關蛋白Nrf2、FTH1、HO-1及NQO1蛋白表達水平較正常對照組顯著降低。通腑養髓方組Nrf2、FTH1、HO-1及NQO1蛋白表達水平較模型組顯著升高。結果提示通腑養髓方通過上調Nrf2信號通路相關蛋白表達水平，進一步抑制鐵死亡。

綜上所述，鐵死亡是WD模型TX小鼠神經細胞損傷的重要機制，通腑養髓方可調控Nrf2信號通路，抑制WD模型TX小鼠神經細胞鐵死亡，是難治性腦型WD神經細胞損傷的潛在治療靶點。本研究對Nrf2信號通路相關因子表達水平的變化情況進行了初步探索，為通腑養髓方對Nrf2信號通路的具體調控機制和作用靶點等后續研究提供了理論基礎。