基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的項(xiàng)痹暈寧湯治療頸椎病的作用機(jī)制研究

賈 媛 高 蘭 公 雯

南京市江寧中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南京 211100

頸椎病是臨床常見的退行性疾病，主要由頸椎間盤變性等引起。臨床主要表現(xiàn)為頸肩部出現(xiàn)陣發(fā)性痙攣或麻木，嚴(yán)重者可致四肢癱瘓[1]。隨著人口老齡化加劇，工作、生活習(xí)慣的改變，其發(fā)病率逐年升高，且年輕化趨勢顯著。

項(xiàng)痹暈寧湯作為南京市江寧中醫(yī)院經(jīng)典驗(yàn)方，臨床上已使用多年。組方為葛根、天麻、當(dāng)歸、炒白芍、玄胡、柴胡、川芎、姜半夏八味，諸藥合用，對于頸椎病臨床療效顯著。但因組方復(fù)雜，其作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過藥理學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科的融合，能夠初步揭示中藥-成分-疾病的作用機(jī)制[2]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探究項(xiàng)痹暈寧湯治療頸椎病的機(jī)制，為后續(xù)新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

選擇TCMSP、BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫，以組方中八味中藥為關(guān)鍵詞檢索化學(xué)成分，未被收錄的中藥通過文獻(xiàn)檢索。以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為限制條件篩選活性成分。再通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，并用UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行規(guī)范。

1.2 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將獲得的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，用“節(jié)點(diǎn)”表示活性成分或潛在靶點(diǎn)，用“邊”表示兩者潛在關(guān)系；再通過Network Analyze工具分析計(jì)算，以推測活性成分和靶點(diǎn)之間的內(nèi)在聯(lián)系[3]。

1.3 篩選頸椎病相關(guān)靶點(diǎn)

以“Cervical spondylosis”“Neck pain”作為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards、Drugbank等疾病數(shù)據(jù)庫，整合與頸椎病相關(guān)的靶基因，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行規(guī)范。

1.4 構(gòu)建蛋白相作網(wǎng)絡(luò)（PPI）及篩選核心靶點(diǎn)

分別將成分潛在靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，生成PPI網(wǎng)絡(luò)后，合并提取交集網(wǎng)絡(luò)。再利用CytoNCA分析各個(gè)節(jié)點(diǎn)的屬性值，并計(jì)算交集PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征屬性值，并對其進(jìn)行策略篩選，最終得到關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。

1.5 通路富集分析

將上述核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，對其進(jìn)行GO及KEGG富集分析，并將結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶點(diǎn)獲取

項(xiàng)痹暈寧湯中滿足條件的活性成分有葛根4種、天麻4種、當(dāng)歸2種、炒白芍8種、玄胡49種、柴胡13種、川芎6種、姜半夏12種，結(jié)果見表1。經(jīng)靶點(diǎn)預(yù)測共獲得244個(gè)藥物靶點(diǎn)。

2.2 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將項(xiàng)痹暈寧湯成分與靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)通過Cytoscape軟件繪制與分析，獲得336個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中84個(gè)活性成分和244個(gè)潛在藥物靶點(diǎn)）與1998條關(guān)系，結(jié)果見圖1。根據(jù)表1、圖1可知，與潛在靶點(diǎn)連線較為緊密的成分有槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、卡維丁等，推測這些化合物可能為項(xiàng)痹暈寧湯主要活性成分。

表1 項(xiàng)痹暈寧湯活性成分

圖1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 頸椎病相關(guān)靶點(diǎn)檢索

檢索GeneCards、Drugbank數(shù)據(jù)庫，匯總整理，累計(jì)獲得1032個(gè)疾病靶點(diǎn)。其與藥物靶點(diǎn)交集有105個(gè)。

2.4 項(xiàng)痹暈寧湯-頸椎病的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建交集PPI網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，與藥物相關(guān)靶點(diǎn)5527個(gè)，相互關(guān)系136 070種；與頸椎病相關(guān)靶點(diǎn)有11 207個(gè)，相互關(guān)系226 832種，再取交集PPI網(wǎng)絡(luò)。依據(jù)交集PPI的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征屬性值，篩選獲得關(guān)鍵核心靶點(diǎn)204個(gè)，見圖2。計(jì)算Degree值，其中排名靠前的神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體 1（NTRK1）、腫瘤蛋白 P53（TP53）、表皮生長因子受體（EGFR）、淀粉樣前體蛋白（APP）等可能是項(xiàng)痹暈寧湯治療頸椎病的主要靶點(diǎn)。

圖2 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 項(xiàng)痹暈寧湯治療頸椎病通路富集分析

將關(guān)鍵核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape，分別對GO及KEGG進(jìn)行富集分析，選取Log10（P）值排名前20的結(jié)果繪制氣泡圖，氣泡面積即基因計(jì)數(shù)，橫坐標(biāo)為通路基因占全部基因的比率，具體見圖3～6。通過P值篩選，結(jié)合文獻(xiàn)，其關(guān)鍵的信號通路可能包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（PI3K/Akt）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等。

圖3 GO BP分析

3 討論

頸椎病是因勞損或風(fēng)寒濕邪入體，痹阻手太陽經(jīng)脈，不通則痛；臨床也認(rèn)為該病是機(jī)體氣血不足，筋脈失養(yǎng)后，氣血虛和太陽經(jīng)脈瘀滯所致[4]。項(xiàng)痹暈寧湯是在中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)組方而成，主要用于治療頸椎病所致的頭頸痛、頭暈?zāi)垦５扰R床癥狀。

圖4 GO CC分析

圖5 GO MF分析

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

本研究共篩選出84種活性成分，244個(gè)藥物靶點(diǎn)。項(xiàng)痹暈寧湯治療頸椎病的主要成分可能為槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、卡維丁等。槲皮素通過上調(diào)神經(jīng)元的內(nèi)在生長能力和延緩遠(yuǎn)端萎縮，增強(qiáng)軸突再生和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)；此外還增加了環(huán)磷酸腺苷的表達(dá)和下游通路的激活，促進(jìn)小鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后的行為恢復(fù)[5-6]。豆甾醇能夠通過對抗IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡NF-κB通路，減少骨關(guān)節(jié)炎引起的軟骨退化[7]；也可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，減少軟骨的降解[8]。β-谷甾醇通過減少合成NO，減少炎性因子的分泌[9]。山柰酚能抑制血小板活化，預(yù)防和治療血栓性疾病[10]。卡維丁可能通過受體阻斷或刺激疼痛神經(jīng)末梢釋放來產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[11]。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示項(xiàng)痹暈寧湯靶點(diǎn)與頸椎病靶點(diǎn)間存在諸多交互關(guān)系，篩選后共得出204個(gè)核心靶點(diǎn)。根據(jù)Degree值排名，NTRK1、YP53、EGFR、APP等可能是項(xiàng)痹暈寧湯治療頸椎病的主要靶點(diǎn)。GO分析發(fā)現(xiàn)，項(xiàng)痹暈寧湯主要涉及DNA修復(fù)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)、對生長因子反應(yīng)等生物學(xué)過程；涉及蛋白質(zhì)域特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等細(xì)胞組分。KEGG生物途徑中看出，PI3K/Akt信號通路激活可抑制頸肌細(xì)胞凋亡，修復(fù)勞損頸肌，恢復(fù)頸椎的靜力平衡[12]。TNF信號通路中TNF-α是引起退變椎間盤炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，可引起IKK活化，加重炎癥損傷。此外miR-146受到TNF-α等刺激時(shí)負(fù)反饋調(diào)節(jié)炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[13-14]。MAPK可能通過炎癥引起的神經(jīng)病理性疼痛潛在的藥物干預(yù)靶點(diǎn)參與細(xì)胞增殖分化[15]。