毛萼乙素通過Wnt/β-catenin通路抑制結腸癌細胞上皮間質轉化Δ

匡微，鄭銀彬，李雨奇，田平平，蘇強，向小聰（.川北醫學院附屬南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所，四川南充 67000；.川北醫學院附屬南充市中心醫院心胸外科，四川南充 67000；.安徽醫學高等專科學校醫學技術學院，合肥 060；4.川北醫學院附屬南充市中心醫院藥學部，四川南充 67000）

結腸癌是一種高異質性疾病，盡管其早期患者可以通過手術和輔助方案治療，但治療后仍有部分患者容易復發[1―2]，且大多數患者在診斷時已經處于中晚期階段，常規療法已經很難有效[3―4]，亟需尋找新的有效治療方案。目前，結腸癌細胞的高轉移特性是導致結腸癌預后不良的主要原因，其中上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤轉移的重要因素。因此，開發可有效抑制結腸癌細胞EMT的藥物尤為重要。

毛萼乙素是從疏花毛萼香茶菜中提取的一種具抗癌活性的二萜類化合物，已有報道顯示，其在急性髓系白血病[5]、乳腺癌[6]、胰腺癌[7]等惡性腫瘤中發揮了較好的治療作用，但其是否可用于治療結腸癌尚不明確。目前已有研究發現，異常的Wnt/β-聯蛋白（β-catenin）激活可直接驅動結腸癌的進展和轉移[8―10]，但毛萼乙素是否可通過該信號通路治療結腸癌尚不明確。基于此，筆者以結腸癌細胞HT29、HCT116為研究對象，探討毛萼乙素對上述2種細胞侵襲、遷移的影響，并基于Wnt/β-catenin信號通路初探毛萼乙素對結腸癌細胞EMT的作用，以期為毛萼乙素治療結腸癌提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有TS100F型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）、DMi8型倒置顯微鏡（德國Leica公司）、810FUGE型低溫高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）、TD-5Z型臺式低速多管架離心機（四川蜀科儀器有限公司）、DYY-6D型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Gel Doc XR+全自動凝膠成像系統（上海艾研生物科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

毛萼乙素（貨號84745-95-9）購自云南西力生物技術股份有限公司；Licl（Wnt/β-catenin信號通路激活劑）購自北京伊諾凱科技有限公司（貨號A53473）；XAV939（Wnt/β-catenin信號通路抑制劑）購自美國MCE公司（貨號284028-89-3）；兔源原癌基因蛋白質c-myc、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、β-catenin、T細胞因子4（TCF4）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、鋅指轉錄抑制因子Snail、β-肌動蛋白（β-actin）均購自山東華安生物科技有限公司（貨號分別為HA721182、ET107-37、ET1607-15、ET1601-5、R1401-11、ER0722、EM1706-65、ET1701-80）；羊抗免疫球蛋白G二抗購自美國Sigma公司（貨號A6154）；ECL化學發光試劑購自上海雅酶生物科技有限公司（貨號SQ201）；McCoy’s 5A培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司（貨號分別為16600108、10100147）。

1.3 細胞

結腸癌細胞HT29、HCT116購自中國科學院細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養

將HT29細胞或HCT116細胞培養于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A完全培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

2.2 毛萼乙素對結腸癌細胞遷移能力的影響

將6孔板背面用記號筆畫3條橫穿過孔的直線，然后將HT29或HCT116細胞以1.5×105個/孔接種于6孔板中，待細胞完全貼壁后，使用槍頭在細胞生長面垂直于背后直線劃痕，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗掉落的細胞。將上述2種細胞分為對照組和毛萼乙素不同濃度組（1.0、1.5 μmol/L，濃度參考文獻[5]設置），每組設3個復孔。培養0、24、48 h后，采用倒置顯微鏡觀察劃痕的愈合情況，并拍照。采用Image J v1.8.0軟件測量劃痕的距離，計算細胞遷移率[細胞遷移率＝（0 h劃痕寬度－不同時間點劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%]。

2.3 毛萼乙素對結腸癌細胞侵襲、遷移的影響

2.3.1 Transwell侵襲實驗 取對數生長期的HT29、HCT116細胞，制成細胞密度為5×105mL－1的無血清細胞懸液，分別給予0（對照組）、1.0 μmol/L（濃度根據“2.2”項下實驗結果設置，下同）的毛萼乙素刺激，每組設置3個復孔。取上述細胞懸液200 μL加到Transwell小室上層，下層中加入含20%胎牛血清的McCoy’s 5A培養基600 μL。將細胞侵襲小室置于培養箱中培養24 h，然后以4%多聚甲醛固定30 min，再用1%結晶紫染色30 min后，于倒置顯微鏡下觀察穿過基底膜的侵襲細胞數。每個樣本觀察5個視野，取平均值作為檢測結果。實驗重復3次，然后計算細胞侵襲率[細胞侵襲率＝（對照組侵襲數－實驗組侵襲數）/對照組侵襲數×100%]。

2.3.2 Transwell遷移實驗 實驗前，在Transwell小室內膜上均勻鋪入稀釋后的Matrigel 50 μL，待其凝結后，取對數生長期的HT29、HCT116細胞，制成細胞密度為1×106mL－1的無血清細胞懸液，分別給予0（對照組）、1.0 μmol/L的毛萼乙素刺激，每組設置3個復孔。其余操作同“2.3.1”項，然后計算細胞遷移率[細胞遷移率＝（對照組遷移數－實驗組遷移數）/對照組遷移數×100%]。

2.4 毛萼乙素對結腸癌細胞中EMT相關蛋白表達的影響

采用Western blot法進行實驗。取HT29細胞或HCT116細胞按2×105個/孔接種于6孔板后分為對照組和毛萼乙素0.5、1.0、1.5 μmol/L組。培養24 h后，收集細胞，加入RIPA裂解液裂解20 min，離心，取上清液，經BCA法檢測蛋白濃度后，進行變性、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜；以5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，PBST緩沖液清洗5 min×3次后，加入E-cadherin、N-cadherin、Snail、β-actin一抗（稀釋度均為1∶500）孵育過夜；以PBST緩沖液清洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1∶5 000）孵育1 h；加入ECL化學發光試劑顯色，以全自動凝膠成像系統成像，采用Image J v1.8.0軟件進行分析，以目的蛋白與內參（β-actin）的灰度值比值表示其表達水平。

2.5 毛萼乙素聯合Wnt/β-catenin信號通路激動劑對該信號通路相關蛋白及N-cadherin蛋白表達的影響

采用Western blot法進行實驗。取HT29細胞或HCT116細胞按2×105個/孔接種于6孔板后，分為對照組、毛萼乙素組（1.0 μmol/L）、Licl[11]組（10 mmol/L）、毛萼乙素+Licl組（1.0 μmol/L毛萼乙素+10 mmol/L Licl）。培養24 h后，收集細胞，按“2.4”項下方法處理細胞并進行電泳，然后加入β-catenin、c-myc、cyclin D1、TCF4、N-cadherin、β-actin一抗（稀釋度均為1∶500）孵育過夜；以PBST緩沖液清洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1∶5 000）孵育1 h，按“2.4”項下方法進行顯色及灰度值分析。

2.6 毛萼乙素聯合Wnt/β-catenin信號通路抑制劑對結腸癌細胞遷移率及β-catenin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達的影響

將6孔板背面用記號筆畫3條橫穿過孔的直線，然后將HT29細胞或HCT116細胞按1.5×105個/孔接種于6孔板中，待細胞完全貼壁后，分別給予0（對照組）、1.0 μmol/L 的毛萼乙素以及 10 μmol/L XAV939[12]和 1.0 μmol/L毛萼乙素+10 μmol/L XAV939刺激，每組設置3個復孔，同“2.2”項下方法進行劃痕愈合實驗，并檢測培養24、48 h后的細胞遷移率。取HT29細胞或HCT116細胞按2×105個/孔接種于6孔板后分為對照組、毛萼乙素組（1.0 μmol/L）、XAV939組（10 μmol/L）、毛萼乙素+XAV939組（1.0 μmol/L毛萼乙素+10 μmol/L XAV939）。培養24 h后，收集細胞，按“2.4”項下方法處理細胞并進行電泳，然后加入β-catenin、N-cadherin、E-cadherin、β-actin一抗（稀釋度均為1∶500）孵育過夜；以PBST緩沖液清洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1∶5 000）孵育1 h，按“2.4”項下方法進行顯色及灰度值分析。

2.7 統計學方法

所有數據使用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 毛萼乙素對結腸癌細胞遷移能力的影響結果

與對照組比較，毛萼乙素1.0、1.5 μmol/L組2種結腸癌細胞的遷移率均顯著降低（P＜0.01），且呈一定濃度和時間依賴趨勢。結果見圖1。

圖1 毛萼乙素對2種結腸癌細胞遷移能力的影響結果

3.2 毛萼乙素對結腸癌細胞侵襲、遷移的影響結果

與對照組比較，毛萼乙素1.0 μmol/L組2種結腸癌細胞的侵襲率及遷移率均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 毛萼乙素對2種結腸癌細胞侵襲、遷移的影響結果

3.3 毛萼乙素對結腸癌細胞EMT相關蛋白表達的影響結果

與對照組比較，毛萼乙素1.0、1.5 μmol/L組2種結腸癌細胞中N-cadherin、Snail表達水平均顯著降低（P＜0.01），E-cadherin表達水平均顯著升高（P＜0.01）；毛萼乙素0.5 μmol/L組HT29中E-cadherin表達水平顯著升高（P＜0.01），HCT116細胞中Snail表達水平顯著降低（P＜0.05），表明毛萼乙素可以抑制結腸癌細胞EMT。結果見圖3、表1。

表1 2種結腸癌細胞中EMT相關蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3，%%）

表1 2種結腸癌細胞中EMT相關蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3，%%）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與對照組比較，P＜0.05

組別對照組毛萼乙素0.5μmol/L組毛萼乙素1.0μmol/L組毛萼乙素1.5μmol/L組HCT116細胞134.18±2.78 118.52±5.21b 100.42±7.43a 92.84±5.41a E-cadherin HT29細胞52.56±2.01 65.88±3.22a 80.83±5.11a 95.12±4.32a HCT116細胞57.54±4.51 68.75±5.63 79.66±8.98a 87.84±4.74a N-cadherin HT29細胞102.21±10.52 88.45±3.51 22.01±2.41a 12.89±3.31a HCT116細胞25.68±2.57 24.14±3.10 11.39±4.22a 1.50±0.01a Snail HT29細胞82.93±2.41 77.72±2.54 58.49±3.21a 47.66±2.21a

圖3 2種結腸癌細胞中EMT相關蛋白表達的電泳圖

3.4 毛萼乙素聯合Wnt/β-catenin信號通路激動劑對該信號通路相關蛋白及N-cadherin蛋白表達的影響結果

與對照組比較，毛萼乙素組2種結腸癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白（β-catenin、c-myc、cyclin D1、TCF4）及N-cadherin的表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；Licl組2種結腸癌細胞中上述幾種蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與毛萼乙素組比較，毛萼乙素+Licl組2種結腸癌細胞中上述幾種蛋白的表達水平被顯著逆轉（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖4、表2。

表2 2種結腸癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白及N-cadherin蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3，%%）

表2 2種結腸癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白及N-cadherin蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3，%%）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與對照組比較，P＜0.05；c：與毛萼乙素組比較，P＜0.05；d：與毛萼乙素組比較，P＜0.01

組別c-myc對照組毛萼乙素組Licl組毛萼乙素+Licl組β-catenin HT29細胞134.79±5.67 106.03±5.64a 149.65±4.21b 121.53±6.54c HCT116細胞104.24±5.47 82.62±8.12b 120.56±5.12b 101.08±8.12c HT29細胞40.64±1.53 19.68±4.57a 50.89±4.25b 35.31±3.21d HCT116細胞77.92±2.04 62.31±2.64b 106.10±4.25a 95.8±11.64d cyclinD1 HT29細胞18.85±3.21 12.39±1.19b 29.94±1.21a 24.79±3.92d HCT116細胞116.48±2.32 84.31±1.52a 128.66±3.41b 104.73±7.21d TCF4 HT29細胞69.07±5.21 18.00±3.11a 95.81±4.85a 64.95±3.47d HCT116細胞77.62±1.69 13.34±4.41a 86.54±2.21b 75.90±3.21d N-cadherin HT29細胞17.67±2.51 0.92±0.01a 23.68±0.95b 21.21±3.29d HCT116細胞25.15±4.21 7.86±0.59a 78.17±1.12a 28.15±3.13d

圖4 2種結腸癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白及N-cadherin表達的電泳圖

3.5 毛萼乙素聯合Wnt/β-catenin信號通路抑制劑對結腸癌細胞遷移率和β-catenin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達的影響

與對照組比較，毛萼乙素組2種結腸癌細胞的遷移率及β-catenin、N-cadherin表達水平均顯著降低（P＜0.01），E-cadherin表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與毛萼乙素組比較，毛萼乙素+XAV939組2種結腸癌細胞的遷移率及β-catenin、N-cadherin表達水平均進一步降低（P＜0.05或P＜0.01），E-cadherin表達水平進一步升高（P＜0.01）。結果見圖5、表3。

表3 2種結腸癌細胞中 β-catenin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3，%%）

表3 2種結腸癌細胞中 β-catenin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3，%%）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與對照組比較，P＜0.05；c：與毛萼乙素組比較，P＜0.05；d：與毛萼乙素組比較，P＜0.01

HCT116細胞447.02±16.84 300.53±10.64a 245.63±9.98a 131.48±8.31d組別對照組毛萼乙素組XAV939組毛萼乙素+XAV939組β-catenin HT29細胞103.58±8.26 68.98±3.74a 79.40±2.56a 55.44±2.21c HCT116細胞175.17±9.81 102.92±9.22a 94.89±7.43a 72.78±6.12d E-cadherin HT29細胞29.22±2.36 62.32±4.27b 104.48±14.87a 149.43±10.62d HCT116細胞60.08±2.76 92.08±3.80a 71.80±2.31b 134.52±5.98d N-cadherin HT29細胞63.97±3.51 42.41±1.13a 36.23±1.60a 21.51±2.95d

圖5 毛萼乙素聯合XAV939對2種結腸癌細胞遷移能力及β-catenin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達的影響

4 討論

腫瘤轉移是結腸癌相關死亡的主要原因[13―14]，轉移性結腸癌預后較差，傳統的治療方法如手術切除和化療并不能有效防止腫瘤轉移[15]。目前臨床仍缺乏能夠有效抑制結腸癌細胞轉移的方案，因此，開發抗結腸癌細胞轉移藥物顯得尤為重要。

細胞的侵襲和遷移是結腸癌發生轉移的重要過程[16]。本研究通過劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測毛萼乙素抑制結腸癌細胞侵襲和遷移的能力，結果發現毛萼乙素能夠顯著降低結腸癌細胞的侵襲率和遷移率，且其遷移能力具有一定濃度和時間依賴趨勢。

EMT是腫瘤細胞轉移最主要的原因[17]，故本研究檢測不同濃度毛萼乙素處理結腸癌細胞后EMT相關蛋白的表達水平。結果發現，毛萼乙素能夠抑制結腸癌間質細胞標志物N-cadherin以及與EMT呈正相關的轉錄因子Snail的表達，同時還能促進上皮細胞表型標志物E-cadherin的表達，這表明毛萼乙素可以抑制結腸癌細胞EMT。

目前研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路是調節結腸癌EMT的關鍵信號通路[18]，且其在結腸癌中被高度激活[19―20]，因此，抑制該信號通路活性對結腸癌的治療具有重要作用。本研究通過檢測Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin及其下游靶蛋白（c-myc、cyclin D1、TCF4）的表達情況，并通過利用該信號通路激活劑Licl進行功能回復實驗，以探討毛萼乙素抑制結腸癌細胞EMT是否與抑制Wnt/β-catenin信號通路激活有關。結果發現，毛萼乙素可以抑制Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達，且該抑制作用能被該信號通路激活劑Licl逆轉，這表明毛萼乙素可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活抑制結腸癌細胞EMT。

為進一步研究毛萼乙素在今后臨床轉化中的應用價值，本研究檢測毛萼乙素與Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939的相互作用。結果發現，兩者聯用后，結腸癌細胞遷移率及β-catenin、N-cadherin蛋白表達水平進一步降低，這表明毛萼乙素與Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939之間存在協同作用。

綜上所述，毛萼乙素可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活抑制結腸癌細胞EMT。