藍薊滇紫草的質量標準研究Δ

王倩倩，龐克堅，高薇，張珂，陳韓英，張波，2#（.石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆石河子 832002；2.成都大學藥學院/四川省抗菌素工業研究所，成都 6006）

紫草藥材具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑的功效，常用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等癥[1]。紫草藥材中的主要化學成分紫草素及其衍生物羥基萘醌類總色素已被證實具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調節免疫等多種藥理活性[2]。2020年版《中國藥典》（一部）收錄的紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.或內蒙紫草A.guttata Bunge的干燥根。但是，內蒙紫草的野生資源匱乏，市場上流通的內蒙紫草多為人工栽培品，其活性成分含量遠低于新疆紫草，價格相對較低，因而藥用價值和經濟價值均遜色于新疆紫草。隨著市場對藥用紫草需求的不斷增加，野生的新疆紫草受到無節制的盜采盜挖，資源已嚴重匱乏，已被列為國家二級瀕危保護物種，但其人工大面積種植尚未開展，導致供求關系緊張，亟待尋找新的紫草藥用來源。

藍薊滇紫草為紫草科植物藍薊滇紫草Onosma echioidesL.的干燥根，又名昭蘇滇紫草，為巴基斯坦常用藥材，主要產于喜馬拉雅山區域、克什米爾地區、西伯利亞地區、法國部分地區和我國新疆西部[3]，資源較為豐富。有研究證明，藍薊滇紫草可用于傷口、瘀傷和皮疹的治療，并具有驅蟲、解毒的作用[4]；其提取物具有治療糖尿病及其并發癥、皮膚癌和促進傷口愈合的作用[5―6]。藍薊滇紫草中的羥基萘醌類成分（如紫草素、左旋紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧等）被證實具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種藥理活性[7―9]。目前，藍薊滇紫草已在我國市場上流通，但關于其質量控制方面的文獻鮮有報道。鑒于此，本課題組擬從性狀、鑒別、檢查和含量測定等方面對藍薊滇紫草進行研究，旨在建立該藥材的質量標準，為科學評價其質量提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有DM500型生物顯微鏡（德國Leica公司）、硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司，規格10 cm×20 cm）、BT125D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）、KH-300DE型臺式數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）、DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）、Agilent 1260型高效液相色譜（HPLC）儀[安捷倫科技（中國）有限公司]、UV-2600型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）等。

1.2 主要試劑與藥材

本研究所用的主要試劑與藥材有左旋紫草素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號Y16O10L100405，純度99.7%）、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品（上海源葉生物技術有限公司，批號P15J10F90876，純度98.2%）；甲酸、甲醇和乙腈均為色譜純，甲苯、環己烷、乙酸乙酯、95%乙醇、無水乙醇、石油醚均為分析純，水為Milli-Q超純水。16批藍薊滇紫草藥材采自不同產地（表1），經新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室龐克堅研究員鑒定，均為紫草科植物藍薊滇紫草O.echioidesL.的干燥根。

表1 16批藍薊滇紫草藥材樣品的來源信息

2 方法與結果

2.1 性狀

藍薊滇紫草藥材呈不規則的長圓柱形，多扭曲，長6～21 cm，直徑0.5～3 cm。由于富含色素，表面呈暗紅色或紫紅色，有時頂端可見有分歧的莖殘基。體輕，質松軟，易斷且斷面不整齊。外皮由多層栓皮組成，疏松，易剝落；木質部呈黃白色或黃色。其具有特殊氣味，微苦、澀。16批藍薊滇紫草藥材樣品的外觀性狀見圖1。

圖1 16批藍薊滇紫草藥材樣品的外觀性狀

2.2 粉末顯微鑒別

藍薊滇紫草藥材粉末呈紫紅色或深紫紅色。顯微鏡下可見非腺毛單細胞，直徑12～58 μm，大小長短不等，基部膨大成喇叭狀，細胞壁具縱細條紋，胞腔內一般含有紫紅色色素。栓化細胞呈棕色或紅棕色，表面呈多角形或圓多角形，含有紫紅色色素。薄壁細胞較多，呈淡棕色或無色，有的含有紫紅色色素。導管主要為網紋導管，少有具緣紋孔導管，偶見螺紋導管，直徑7～120 μm。藍薊滇紫草藥材粉末的顯微鑒別特征見圖2。

圖2 藍薊滇紫草藥材（5號）粉末的顯微鑒別特征

2.3 薄層色譜鑒別

按2020年版《中國藥典》（四部）通則0502操作要求[10]，取藍薊滇紫草藥材粉末（5號）0.5 g，加石油醚（60～90℃）20 mL，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）20 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液[1]。另取左旋紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品各適量，加無水乙醇溶解，分別配制成質量濃度為0.37、1.01 mg/mL的單一成分對照品溶液。吸取供試品溶液和對照品溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液顯色。結果顯示，供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上顯現相同的紫紅色斑點，斑點大小、深淺略有不同，噴顯色劑顯色后斑點變為藍色，詳見圖3。

圖3 16批藍薊滇紫草藥材樣品的薄層色譜鑒別結果

2.4 雜質、水分、總灰分和酸不溶性灰分檢查

按2020年版《中國藥典》（四部）通則2301、通則0832（第二法：烘干法）和通則2302方法測定16批藥材樣品的雜質、水分、總灰分和酸不溶性灰分[10]，平行測定3次，取平均值，結果見表2。由表2可知，16批藥材樣品中雜質含量為0.24%～0.81%，均未超過1.0%；水分含量為10.15%～12.11%，總灰分為9.72%～17.26%，酸不溶性灰分為0.93%～5.66%。考慮到藥材來源差異并參考文獻[11]，本研究以略高于測定值設限，建議藍薊滇紫草藥材中水分不得過13.0%，總灰分不得過18.0%，酸不溶性灰分不得過6.0%。

表2 16批藍薊滇紫草藥材樣品中雜質、水分、總灰分和酸不溶性灰分測定結果（n＝3，%%）

2.5 紫外-可見分光光度法測定羥基萘醌總色素含量

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取左旋紫草素對照品20.25 mg，置500 mL量瓶中，以95%乙醇溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為40.5 μg/mL的左旋紫草素對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 參考2020年版《中國藥典》（一部）“紫草”項下方法制備供試品溶液[1]：取藍薊滇紫草藥材樣品適量，于50℃干燥3 h，粉碎（過三號篩），取約0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加95%乙醇溶解并定容，在4 h內時時振搖，濾過，精密量取續濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻，即得。

2.5.3 檢測波長的選擇 取“2.5.1”項下對照品溶液6 mL，置于10 mL量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻。取該溶液，以95%乙醇為空白試劑，在400～800 nm波長范圍內進行掃描，結果顯示，左旋紫草素對照品在（516±1）nm波長處有最大吸收峰，與2020年版《中國藥典》（一部）“紫草”項下檢測波長一致[1]，因此選擇516 nm為檢測波長。

2.5.4 標準曲線的繪制 取“2.5.1”項下對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于 10 mL 量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻，配制成質量濃度分別為8.1、16.2、24.3、32.4、40.5 μg/mL的系列標準溶液。以左旋紫草素對照品的質量濃度（X）為橫坐標、對應的吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得其回歸方程為Y＝0.024 2X—0.003 3（R2＝0.999 9）。結果表明，左旋紫草素在 8.1～40.5 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.5.5 精密度試驗 取供試品溶液（5號），在516 nm波長處連續測定吸光度6次。結果顯示，吸光度的RSD＝0.10%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液（5號），分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時在516 nm波長處測定吸光度。結果顯示，吸光度的RSD＝0.17%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內穩定。

2.5.7 重復性試驗 取藍薊滇紫草樣品（5號），共6份，分別按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，在516 nm波長處測定吸光度，以吸光度計算樣品含量。結果顯示，樣品中左旋紫草素的平均含量為2.19%，RSD＝0.53%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗 分別稱取同一已知左旋紫草素含量的藍薊滇紫草藥材樣品（5號）粉末約0.25 g，共6份，精密稱定，精密加入相應量的左旋紫草素對照品，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，在516 nm波長處測定吸光度，計算加樣回收率。結果顯示，平均加樣回收率為99.20%，RSD＝1.30%（n＝6），表明該方法準確度良好。

2.5.9 羥基萘醌總色素的含量測定 取16批藥材樣品，分別按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，在516 nm波長處測定吸光度，以吸光度計算樣品中羥基萘醌總色素的含量，重復測定3次，取平均值。結果顯示，以左旋紫草素計，1～16號藍薊滇紫草藥材樣品中羥基萘醌總色素的含量分別為 0.99%、2.31%、0.93%、7.51%、2.19%、0.88%、1.18%、1.99%、0.56%、2.70%、1.50%、5.38%、2.73%、1.17%、1.36%、2.71%，平均含量為2.25%。以不合格率低于樣本量的20%設限，加之2020年版《中國藥典》（一部）規定紫草藥材中羥基萘醌總色素含量不得少于0.80%，故本研究建議藍薊滇紫草藥材中羥基萘醌總色素的含量不得少于0.80%。

2.6 HPLC法測定左旋紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量

參考文獻[12―13]操作。

2.6.1 溶液的制備 （1）混合對照品溶液：取左旋紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品各約10 mg，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容，即得左旋紫草素質量濃度為1.12 mg/mL、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧質量濃度為1.16 mg/mL的單一成分對照品貯備液。分別取2種對照品貯備液200 μL、1 mL，置于同一個10 mL量瓶中，加乙腈配制成左旋紫草素質量濃度為22.4 μg/mL、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧質量濃度為116 μg/mL的混合對照品溶液。（2）供試品溶液：取藥材樣品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚（60～90℃）25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再次稱定質量，用石油醚（60～90℃）補足減失的質量，搖勻，濾過；精密量取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加乙腈溶解并轉移至10 mL量瓶中，加乙腈定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.6.2 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%甲酸水溶液（70∶30，V/V）；流速為1 mL/min；檢測波長為275 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。在此色譜條件下，取“2.6.1”項下混合對照品溶液和供試品溶液進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，2種待測成分色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數均不低于2 000，空白對照無干擾（圖略），詳見圖4。

圖4 混合對照品溶液和供試品溶液的HPLC圖

2.6.3 線性關系考察 精密吸取“2.6.1”項下2種對照品貯備液各0.02、0.1、0.5、1.0、2.0 mL，分別置于5個10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得各系列濃度的混合對照品溶液；再按“2.6.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各對照品質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得左旋紫草素的回歸方程為 Y＝15.721 2X—2.371 6（r＝0.999 9），線性范圍為2.240～224.0 μg/mL；β，β′-二甲基異丙酰阿卡寧的回歸方程為Y＝11.607 5X－4.468 4（r＝0.999 9），線性范圍為2.320～232.0 μg/mL。

2.6.4 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按“2.6.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，左旋紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積的RSD分別為0.18%、0.18%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6.5 重復性試驗 精密稱取同一批藍薊滇紫草藥材樣品（5號）粉末，共6份，分別按“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算樣品含量。結果顯示，左旋紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量的RSD分別為2.86%、2.92%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.6.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（5號）10 μL，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.6.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，左旋紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積的RSD分別為2.93%、0.49%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.6.7 加樣回收率試驗 取已知含量的藍薊滇紫草藥材樣品（5號）粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，置不同的具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的左旋紫草素和β，β′-二甲基異丙酰阿卡寧對照品溶液，按“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。由表3可知，上述2種成分的加樣回收率分別為101.67%、99.75%，RSD分別為2.32%、2.72%，表明該方法準確度良好。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.6.8 左旋紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量測定 取16批藥材樣品，分別按“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算樣品中左旋紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量，每批樣品平行測定2次，取平均值，結果見表4。結果顯示，16批樣品中上述2種成分的含量范圍分別為0.039～0.880、0.143～24.889 mg/g，平均含量分別為0.232、4.558 mg/g。綜合測定結果，按不合格率低于樣本量的20%進行限定，建議藍薊滇紫草藥材中左旋紫草素含量不得少于0.06 mg/g，β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量不得少于0.60 mg/g。

表4 左旋紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量測定結果（n＝2，mg/g）

3 討論

本研究方法參考了2020年版《中國藥典》（一部）“紫草”項下方法[1]，并在其基礎上增加了總灰分、酸不溶性灰分檢查和左旋紫草素的含量測定。由本研究結果可知，所建方法簡便、可靠，方法學考察結果均符合《中國藥典》要求，可以為科學評價藍薊滇紫草藥材的質量提供參考。

藍薊滇紫草的外觀、性狀、粉末特征與紫草非常相似。紫草萘醌類化合物是這類藥材的主要活性成分，其中左旋紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧是其重要的質量標志性成分，均具有良好的藥理活性[2，14]。因此，本研究測定了藍薊滇紫草藥材中羥基萘醌總色素以及左旋紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量。結果顯示，藍薊滇紫草藥材中羥基萘醌總色素的含量較高，其建議限度與2020年版《中國藥典》（一部）“紫草”一致（即不得少于0.80%）。2020年版《中國藥典》（一部）規定紫草藥材中β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量不得少于0.30%，本研究建議藍薊滇紫草藥材中該成分的含量不得少于0.60 mg/g（即0.06%），低于前述紫草標準，這可能是因為藥材品質不均所造成的。

本研究發現，不同批次間藍薊滇紫草藥材樣品的總灰分、酸不溶性灰分、羥基萘醌總色素、左旋紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量有所差異，這是因為中藥材具有地域性、有限性和復雜性等特點，自然因素和采收加工等人為因素均會對其品質產生影響，造成不同批次的藥材質量參差不齊[15]。從本研究結果可知，2、4、5、8、10、12、13、15、16號樣品質量較好，各項指標均能達到2020年版《中國藥典》“紫草”的限定要求，而9號樣品的質量相對較差，所含羥基萘醌總色素、左旋紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量均最低；另外，相同產地不同批次的樣品質量也存在差異（如2、4、5、8號樣品與3、9號樣品均來自巴基斯坦，但前4批樣品質量更優，所含主要活性成分含量較高）。因此，仍需采集更多產地藥材以建立更完善的質量標準。

本研究僅對藍薊滇紫草藥材做了質量標準研究，未來需對其與新疆紫草或內蒙紫草等其他類紫草進行質量比較研究，以期更科學地判斷其作為紫草入藥的可行性。另外，現代研究表明，中藥材具有多成分特點，通過多途徑、多靶點協同發揮藥效，為了確保藍薊滇紫草藥材的安全性和臨床有效性，未來還需測定其所含的多個藥效成分來共同評價其內在質量。