基于網絡藥理學及分子對接探討蒙藥三味阿拉坦其其格散治療功能性消化不良的作用機制

彭斯格熱希 薩仁高娃 吉日木巴圖

內蒙古醫科大學民族醫藥創新中心，內蒙古呼和浩特 010110

蒙藥三味阿拉坦其其格散（簡稱三味散），別名三味木鱉子散、日來那木吉樂，由玫瑰花、金色訶子、木鱉子組成，該方劑最早記載于《蒙醫金匱》[1]中，根據《蘭塔布》[2]等蒙醫古文獻和臨床經驗，三味散是唯一主治綜合性蒙醫希拉病的方劑。方中玫瑰花能聚攏擴散之消化希拉，為主藥；金色訶子清除寒熱二種希拉病，為輔藥；木鱉子清希拉熱，為佐藥，對熱性和寒性希拉病均有療效[3]。從三味散的單味藥功效來看，玫瑰花能行氣解郁、調和氣血、止痛，用于治療食少嘔惡、肝胃氣痛、月經不調、跌撲傷痛，清希拉、祛赫依功能，治希拉病[4-5]。金色訶子能滋補身體、溫胃消食、調理體素功能，治赫依、希拉、巴達干等諸疾[5]。木鱉子能清希拉，清熱解毒，治胃腸希拉、黃疸、消化不良、腹脹、肝膽脾熱[5]。可見，三種單味藥都對胃腸病有療效。

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是臨床常見的功能性胃腸道疾病，起源于胃十二指腸區域，反復發作，無器質性改變，具有上腹脹、食欲不振、餐后飽脹和不適、早飽、上腹部灼燒、惡心和嘔吐等癥狀[6]。調查顯示，FD的全球發病率為5.3%～20.4%[7-8]。FD具有反復發作、難以緩解的特點，造成患者反復就醫，甚至嚴重影響患者的生活質量，消耗大量的醫療資源[9]。

1 資料與方法

1.1 三味散有效成分和靶點基因收集

通過BATMAN數據庫和TCMSP平臺以木鱉子、玫瑰花、金色訶子為關鍵詞檢索其有效成分和靶點基因，BATMAN數據庫設定為Score≥20進行篩選，TCMSP平臺篩選條件為口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，最后得到三味散有效成分及其靶點基因。

1.2 FD靶點收集

通過GeneCards數據庫和OMIM數據庫以“functional dyspepsia”為關鍵詞檢索關于FD疾病靶點。

1.3 “活性成分-作用靶點”網絡圖繪制

使用DrawVennDiagram網站對三味散靶點基因和FD疾病靶點取交集靶點，并利用交集靶點在Cytoscape軟件繪制三味散“活性成分-作用靶點”網絡圖，隨后使用Cytoscape軟件中Network Analyzer分析功能對其進行拓撲學分析，根據節點的度值篩選核心活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）網絡構建

在STRING平臺對獲得的交集靶點進行PPI網絡繪制，并將PPI網絡信息導入Cytoscape軟件中，繪制三味散蛋白質-蛋白質PPI網絡圖，隨后使用Cytoscape軟件中Network Analyzer分析功能進行拓撲學分析，根據節點的度值篩選核心蛋白。

1.5 KEGG富集分析

利用DAVID數據庫對交集靶點進行KEGG富集分析，設定閾值P≤0.5，通路分析選擇KEGG，并將得到網絡數據使用Rstudio和Cytoscape軟件進行可視化分析，繪制其排名前20個條目的氣泡圖和“通路-靶點”網絡圖。

1.6 分子對接

將“活性成分-作用靶點”網絡圖中度值最高的5個核心活性成分與PPI網絡中節點度值最高的5個核心蛋白用AutoDockTools軟件進行分子對接，驗證其相互作用強度，通過PubChem數據庫獲取核心活性成分結構，通過RCSB PDB數據獲取核心蛋白結構，分子對接結果借助Pymol軟件進行優化制圖。

2 結果

2.1 三味散有效成分及其靶點獲取

以OB≥30%、DL≥0.18為 篩 選 條 件 在TCMSP平臺進行篩選，以Score≥20為篩選條件在BATMAN數據庫進行篩選，收集到亞油酸、槲皮素、油酸等有效成分47個，其中木鱉子9個、玫瑰花18個、金色訶子22個，木鱉子和玫瑰花共有1個、玫瑰花和金色訶子共有1個，共得到其相應的1001個靶點基因。

2.2 FD靶點獲取

檢 索 詞 選 擇“functional dyspepsia”，收 集FD靶點，從GeneCards和OMIM數據庫中共收集到2476個疾病靶點，取疾病靶點與藥物靶點基因的交集，得到兩者297個交集靶點。

2.3 三味散“活性成分-作用靶點”網絡圖分析

使用Cytoscape繪制297個交集靶點的三味散“活性成分-作用靶點”網絡圖，見圖1，網絡圖通過Cytoscape軟件中Network Analyzer功能計算分析，得到347個節點，1109個邊條，平均度值為6.4，根據度值篩選排名前10名的核心活性成分，見表1。

表1 度值前10的核心活性成分

圖1 三味散“活性成分-作用靶點”網絡圖

2.4 PPI網絡分析

將297個交集靶點，導入STRING數據庫，進行PPI網絡分析，對獲取到的網絡數據使用Cytoscape軟件繪制PPI網絡圖，見圖2，并進行拓撲學分析，得到了295個節點，5475條邊，平均度值為37.1，根據度值篩選前10的核心蛋白，見表2。

表2 度值前10的核心蛋白

圖2 PPI網絡圖

2.5 KEGG富集分析

使用DAVID數據庫對297個交集靶點進行KEGG通路富集分析，根據校正后P值進行排序，共獲得到135條（P≤0.05）信號通路，選擇度值排名前20的核心通路繪制氣泡圖，見圖3；“通路-靶點”網絡圖見圖4。

圖3 KEGG富集分析氣泡圖

圖4 “通路-靶點”網絡圖

2.6 分子對接

利用AutoDockTools軟件將“活性成分-作用靶點”網絡圖中得到的節點度值最高的5個核心活性成分亞油酸、槲皮素、油酸、蕨素A、去甲氧基茵陳色原酮分別與PPI網絡圖中排名前5位的INS、AKT1、IL6、MAPK3、EGFR核心蛋白進行分子對接，分子對接詳細結果見圖5，分子對接構象見圖6，其中槲皮素與AKT1（-7.9 kCal/mol）結合性最好，從圖中可看出槲皮素與AKT1相互作用，結合后呈現較強的親和能力。

圖5 核心活性成分與核心蛋白結合熱能圖

圖6 槲皮素與AKT1分子對接圖

3 討論

FD病因和發病機制可能與胃腸運動功能障礙、胃酸分泌異常、腦腸軸及胃腸激素、腸道菌群失調、幽門螺桿菌感染、精神和心理因素、內臟高敏感性、遺傳、環境與飲食習慣和生活方式等密切相關[10]。

對三味散有效成分進行分析，槲皮素具有調節胃腸平滑肌、抗炎和神經保護作用[11]，其可以促進功能性便秘大鼠的胃腸運動[12]，而且實驗證明其對胃腸平滑肌具有雙向調節作用[13]，槲皮素可通過拮抗5-HT受體調節胃腸蠕動，改善呃逆、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀，通過影響p38絲裂原激活蛋白激酶、Bcl-2和Bax的水平，預防與幽門螺桿菌感染相關的細胞凋亡和胃炎[14]。對三味散蛋白進行分析，AKT1是蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，是PI3K-Akt信號通路中的重要調節分子，位于AKT1上游的PI3K可在受到體內細胞因子和內部環境中各種物理和化學因素刺激后被激活，以產生肌醇，肌醇充當第二信使，調節磷酸化的AKT，進而調節下游相關因子，調節許多細胞周期過程，包括新陳代謝、增殖、生存和生長等，下游eNOS是No的調節酶，No作為信號通路的末端及其重要信使分子，具有抑制胃腸蠕動和胃腸肌肉收縮的功能[15-16]。從三味散信號通路分析，PI3K-Akt信號通路是與胃黏膜修復相關的通路，參與修復受損的胃黏膜和胃上皮細胞的細胞周期調控，PI3K-Akt信號通路有可能是治療FC小鼠的功能性便秘的重要路徑[17]。分子對接結果表明槲皮素與AKT1蛋白結合性最好，也最穩定，槲皮素可能通過作用AKT1蛋白調節PI3K-Akt信號通路在治療FD中發揮作用。

綜上所述，本研究初步證明了三味阿拉坦其其格散主要通過其中成分槲皮素作用于AKT1蛋白，并通過PI3K-Akt信號通路，進而治療功能性消化不良，可為進一步實驗研究和臨床應用提供依據。