制藥廢水活性污泥中高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌分離及特性研究

朱研研 王耀耀 任風芝 馬巖 喬玲 張雪霞 張鵬 王勇軍 張利利

(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，石家莊 052165)

隨著醫(yī)藥工業(yè)迅猛的發(fā)展，制藥廢水已成為嚴重的污染源之一。利用單一的處理技術(shù)進行制藥廢水的處理有一定的局限性，近年來，國內(nèi)學者將研究重點放在多種技術(shù)的優(yōu)化組合，核心處理以生物方法為主。而生物法中傳統(tǒng)的厭氧氨氧化工藝菌倍增時間較長，工藝啟動時間長，并且廢水中通常不含亞硝酸鹽，需與短程硝化工藝相結(jié)合。而且厭氧氨氧化過程對廢水中的COD比較敏感，COD的存在會滋生大量的異樣菌，與厭氧氨氧化菌競爭。所以僅通過厭氧氨氧化無法同時去除廢水中的氨氮和COD[1]。

近年來，陸續(xù)有同時具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化作用的微生物被報道。人們最早從脫硫脫氮污水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)具有此特殊性能的菌株Thiosphaera pantotropha[2]。異養(yǎng)硝化好氧反硝化與其他生物脫氮法相比具有很大優(yōu)勢：①可同時去除COD和氨氮，同時在同一個反應(yīng)器中進行硝化反硝化過程極大節(jié)省了占地面積和運行成本[3-4]；②菌體生長速率快，易于在系統(tǒng)中留存；③菌株代謝基質(zhì)和產(chǎn)物的多樣性，利于與其他菌株共存，應(yīng)用范圍較廣[5]；④耐有機負荷，耐溶解氧，脫氮效率高[6]。本文從制藥廢水活性污泥中，通過富集篩選出具有高效脫氮能力的異養(yǎng)硝化好氧反硝化優(yōu)勢菌株，對純化株進行分類鑒定確定歸屬。并根據(jù)純化株生理生化特性，培養(yǎng)特征以及制藥廢水的特點，對其進行脫氮性能研究，獲取了最佳菌劑的脫氮條件。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本實驗所獲菌株來自于河北石家莊市華北制藥集團環(huán)保處理活性污泥。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g/L，琥珀酸鈉2.17 g/L，維氏鹽溶液50 mL/L。維氏鹽溶液：K2HPO46.50 g/L，MgSO4·7H2O 2.50 g/L，NaCl 2.50 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，MnSO4·H2O 0.04 g/L[7]。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.24 g/L，其他成分與含量同富集培養(yǎng)基[7]。

BTB培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.27 g/L，L-天冬酰胺1.00 g/L，0.1%溴百里酚藍酒精溶液5 mL/L，檸檬酸鈉8.50 g/L，KH2PO41.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.00 g/L，CaCl20.20 g/L,FeCl3·6H2O 0.05 g/L，pH7.0～7.3[8]。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，NaC1 5.00 g/L，pH7.0～7.2[8]。

1.2.2 主要試劑及儀器

主要試劑及儀器見表1。

表1 主要試劑及儀器Tab.1 Major reagents and instruments

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

250 mL三角瓶中裝入40 mL富集培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。取4 mL帶活性污泥的制藥廢水轉(zhuǎn)接入富集培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后，從中取4 mL培養(yǎng)液繼續(xù)轉(zhuǎn)接新的滅過菌富集培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h，期間取樣顯微觀察菌株的生長情況。再從中取4 mL富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接新的滅過菌的培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液逐級稀釋，10-4至10-10的稀釋度各取0.1 mL涂布于BTB快速篩選平板上，30℃培養(yǎng)。觀察菌落生長情況，從中挑選不同形態(tài)且菌落周圍有藍色暈圈的菌落接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)成熟后甘油保存于-80℃超低溫冰箱中。

1.3.2 菌株分類鑒定

(1)菌株形態(tài)及生理生化鑒定 將分離得到的純化株制成菌懸液稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征和顯微特征。采用細菌鑒定方法[9]進行革蘭染色、糖醇發(fā)酵、酶反應(yīng)等試驗。

(2)16 SrRNA 測序及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用通用基因組提取試劑盒(Solarbio)提取純化株基因組DNA。以通用引物27F(A:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；1492R(B:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)進行16S rRNA擴增。PCR擴增條件：95℃ 5 min，1個循環(huán)，95℃1 min，55℃退火1 min,72℃延伸3 min，共30個循環(huán)，在72℃后延伸7 min。PCR產(chǎn)物采用DNA回收試劑盒(TaKaRa)回收，與PGEM-T載體連接轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)細胞，挑選克隆提質(zhì)粒，采用EcoRI(TaKaRa)酶切鑒定，陽性克隆送金唯智生物科技有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)過BLAST進行相似性比對，用ClustalX[9]進行同源性分析，MEGA6.0[10]中的neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌株脫氮性能研究及脫氮條件優(yōu)化

(1)菌株異樣硝化好氧反硝化特性研究 將富集分離獲得的菌株接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h進行活化。以5%接種量，將上述活化菌液轉(zhuǎn)接入異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，每250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基，30℃，220 r/min培養(yǎng)，于36 h取樣檢測殘余的氨氮以及NO-3-N和NO-2-N的值。(2)菌株異養(yǎng)硝化好氧反硝化脫氮條件優(yōu)化 以異樣硝化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別考察不同的pH、碳源種類及其含量以及基礎(chǔ)氨氮值等因素對氨氮去除的影響。將富集分離獲得的菌株接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h進行活化。以5%接種量，將上述活化菌液轉(zhuǎn)接入不同考察因素的培養(yǎng)基中，每250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基，30℃，220 r/min培養(yǎng)，于36 h取樣檢測殘余的氨氮，硝酸鹽和亞硝酸鹽的值。

1.3.4 檢測方法

檢測方法見表2。

表2 指標檢測方法Tab.2 Detection method

2 結(jié)果與討論

2.1 異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌富集篩選結(jié)果

制藥廢水活性污泥經(jīng)過富集培養(yǎng)，BTB平板藍斑快速篩選，獲得相對藍斑較大且明顯的3株菌，分別命名為PWAS17，PWAS21和PWAS34。

2.2 菌株形態(tài)特征及生理生化特征

2.2.1 菌株形態(tài)特征(圖1)

圖1 PWAS17、PWAS21和PWAS34 30℃培養(yǎng)24 h顯微形態(tài)及單菌落圖片(油鏡觀察，10×100倍)Fig.1 Micrographia and colony picture of PWAS17,PWAS21 and PWAS34 at 30℃ culturing 24 h(oil mirror observation,10×100times)

3株純化菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24 h特征為，PWAS17菌落大小約1 mm，圓形隆起，邊緣整齊，表面光滑透亮。顯微形態(tài)短桿，似球狀，不產(chǎn)芽胞。革蘭染色紅色，呈陰性；PWAS21菌落大小為6～7 mm，扁平，表面粗糙，邊緣不規(guī)則，灰白色。顯微形態(tài)粗桿，單生或鏈狀生。產(chǎn)芽胞，橢圓或柱形，中生或近中生，不膨大。革蘭染色紫色，呈陽性；PWAS34菌落大小約1 mm，圓形隆起，邊緣整齊，表面光滑透亮，顯微形態(tài)細長桿狀，不產(chǎn)芽胞。革蘭染色紅色，呈陰性。

2.2.2 3株菌生理生化特性

3株菌生理生化特性見表3。

表3 PWAS17，PWAS21和PWAS34生理生化特性Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of PWAS17,PWAS21,and PWAS34

2.3 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

對菌株P(guān)WAS17、PWAS21和PWAS34測序獲得的部分16S rRNA序列經(jīng)過BLAST進行相似性比對，用ClustalX[9]進行同源性分析，MEGA6.0[10]中的neighborjoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示。菌株P(guān)WAS17與產(chǎn)堿桿菌屬聚為一簇，與水生產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes aquatilisLMG 22996同源性達99.58%。菌株P(guān)WAS21與Bacillus cereus聚為一簇，與ATCC14579同源性達99.93%。菌株P(guān)WAS34與假單胞菌聚為一簇，同斯惠假單胞菌Pseudomonas sihuiensisKCTC 32246同源性最高達99.93%。3株菌分別綜合形態(tài)特征和生理生化特征，可確定為PWAS17為水生產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes aquatilis)，PWAS21蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)，PWAS34為斯惠假單胞菌(Pseudomonas sihuiensis)。

圖2 基于16S rRNA基因序列同源性構(gòu)建的菌株P(guān)WAS17，PWAS21和PWAS34系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain PWAS17,PWAS21 and PWAS34 based on the sequence homology of 16S rRNA gene

2.4 菌株脫氮性能研究及脫氮條件優(yōu)化

2.4.1 菌株異養(yǎng)硝化好氧反硝化特性研究

本實驗在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，控制基礎(chǔ)NH4+-N值為50.9 mg/L，以葡萄糖控制基礎(chǔ)COD為600 mg/L，考察接種量5%(活化菌液A=0.936)，30℃，220 r/min培養(yǎng)36 h，3株菌去除NH4+-N和COD的能力以及NO-3-N和NO-2-N的積累情況。結(jié)果如表4所示。PWAS17，PWAS21和PWAS34的氨氮去除率分別為73.36%、70.90%和76.86%，COD去除率分別47.92%、87.50%和83.33%。NO-3-N含量分別為0.05 mg/L、0.10 mg/L和0.10 mg/L，NO-2-N含量均為0.01 mg/L。由此可知3株菌均具有去除NH4+-N的能力，同時降解COD，由此可知3株菌具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化作用。去除NH4+-N的過程中，幾乎無NO-3-N和NO-2-N的積累。

表4 PWAS17，PWAS21 和PWAS34異養(yǎng)硝化好氧反硝化特性Tab.4 Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification characteristic of three strains

2.4.2 菌株異養(yǎng)硝化好氧反硝化脫氮條件優(yōu)化

(1)不同pH對氨氮去除的影響 本實驗在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，接種量為5%(活化菌液A=0.936)，考察pH為5、6、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5和10.0時，30℃，220 r/min培養(yǎng)36 h后3株菌NH4+-N去除率的影響。由圖3可知，3株菌隨著pH的升高有助于NH4+-N的去除，當pH達到9.0時，NH4+-N去除率達到最高。PWAS17達82.36%，PWAS21達75.6%，PWAS34達86.12%。當pH升到9.5后略有往下走的趨勢。綜合分析，確定3株菌去除NH4+-N最優(yōu)pH為9.0。

圖3 不同pH對3株菌氨氮去除率的影響Fig.3 Effects of pH on the nitrogen removal rate of strain PWAS17、PWAS21 and PWAS34

(2)不同碳源對氨氮去除的影響 本實驗在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，調(diào)最優(yōu)pH為9.0，接種量為5%(活化菌液A=0.936)，30℃，220 r/min培養(yǎng)36 h后琥珀酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖和蔗糖5種不同碳源對3株菌NH4+-N去除率的影響。由圖4可知，葡萄糖和蔗糖不利于3株菌的NH4+-N去除，乙酸鈉對于PWAS17，PWAS21有促進作用，而對于PWAS34明顯不利于NH4+-N的去除。琥珀酸鈉和檸檬酸鈉均有利于3株菌NH4+-N的去除，尤以檸檬酸鈉最為明顯，3株菌均達到85%以上，綜合成本問題考慮，確定檸檬酸鈉為最優(yōu)碳源。

圖4 不同碳源對3株菌氨氮去除率的影響Fig.4 Effects of different carbon source on the nitrogen removal rate of strain PWAS17,PWAS21 and PWAS34

(3)碳源不同含量對氨氮去除率的影響 本實驗在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，接種量為5%(活化菌液A=0.936)，調(diào)最優(yōu)pH為9.0，以檸檬酸鈉為唯一碳源，分別以(W/V)0.05% 、0.08%、0.1%、0.3%、0.5%、0.8%和1%的檸檬酸鈉含量為考察對象，30℃，220 r/min培養(yǎng)36 h后3株菌NH4+-N去除率的影響。由圖5可知，隨著檸檬酸鈉含量的增加，3株菌NH4+-N的去除效率逐漸提升，當含量提高到0.5%～0.8%時達到相對高值，當為0.8%時分別為92.11%、88.64%和92.13%。之后隨著檸檬酸鈉含量的提高，去除率隨之下降。由此，確定最佳碳源量為0.8%。

圖5 不同碳源含量對3株菌氨氮去除率的影響Fig.5 Effects of the content of carbon on the nitrogenremoval rate of strain PWAS17 and PWAS21

(4)基礎(chǔ)NH4+-N濃度對其去除率的影響 本實驗在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，接種量為5%(活化菌液A=0.936)，調(diào)最優(yōu)pH為9.0，以0.8%檸檬酸鈉為唯一碳源，220 r/min培養(yǎng)72 h，基礎(chǔ)NH4+-N濃度分別為50、100、200、300、400和500 mg/L時對NH4+-N去除率影響。由圖6可知當基礎(chǔ)氨氮濃度在50～500 mg/L范圍內(nèi)氨氮去除率PWAS17在91.4%上下波動，PWAS21在87.8%上下波動，PWAS34在91.4%上下波動。由此可知，高濃度的基礎(chǔ)氨氮濃度對3株菌的去除氨氮能力沒有明顯的抑制。

圖6 不同基礎(chǔ)氨氮濃度對3株菌氨氮去除率的影響Fig.6 Effects of the content of NH4+-N on the nitrogenremoval rate of strain PWAS17,PWAS21 and PWAS34

2.5 討論

近年來，陸續(xù)有同時具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化作用的微生物被報道，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化 (heterotrophic nitrification-aerobic denitrification，HNAD)菌是一類能夠在有機物存在的條件下將氨氮氧化、在溶解氧存在條件下將亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮代謝為氮氣的微生物。最早由Robertson和Kuenen[11]首次發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)硝化好氧反硝化現(xiàn)象并從脫硫脫氮污水中分離到Thiosphaera pantotropha。近年來，越來越多學者從不同環(huán)境中分離篩選到異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌株用于各種廢水的治理。有報道，研究者從土壤、污水處理反應(yīng)器海洋等環(huán)境中分離到異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌株不動桿菌屬、假單胞菌屬、芽胞菌屬以及鹽單胞菌屬等[12]。但關(guān)于Pseudomonas sihuiensis和Alcaligenes aquatilis相關(guān)報道尚且極少，迄今僅見Hong等[13]于湖泊沉積物表面分離出1株P(guān)seudomonas sihuiensis具有脫氮能力。Alcaligenes aquatilis尚未見報道。本研究是從制藥廢水活性污泥中，通過富集培養(yǎng)，快速篩選出3株具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌株，綜合菌株培養(yǎng)特征、顯微特征、生理生化特性以及16S rRNA 序列分析，將3株菌初步鑒定為Pseudomonas sihuiensis、Alcaligenes aquatilis和Bacillus cereus。通過對其脫氮性能研究，在去除氨氮過程中同時降解COD，同時幾乎無硝基氮和亞硝基氮的積累，實現(xiàn)了同步硝化反硝化過程。對其去除氨氮部分條件pH、碳源種類以及含量探索。確定最優(yōu)pH9.0，0.8%檸檬酸鈉為碳源，PWAS17最高達92.1%，PWAS21最高達88.7%，PWAS34最高達92.1%。并考察了基礎(chǔ)氨氮濃度50～500 mg/L之間時對其氨氮去除的影響，由結(jié)果可知隨著基礎(chǔ)氨氮濃度的提高，氨氮的去除率并未受到明顯影響，由此斷定3株菌對基礎(chǔ)氨氮濃度具有一定的耐受性。

3 結(jié)論

(1)從制藥廢水中分離篩選出3株高效異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌株，分別鑒定為PWAS17水生產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes aquatilis)、PWAS21為蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)，PWAS34為斯惠假單胞菌(Pseudomonas sihuiensis)。

(2)3株異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌去除氨氮最佳pH為9.0，最佳碳源為檸檬酸鈉，最佳碳源含量為0.8%。脫單能力PWAS17最高達92.1%，PWAS21最高達88.7%，PWAS34最高達92.1%。

(3)3株菌對基礎(chǔ)氨氮濃度具有顯著耐受性，在50～500 mg/L范圍內(nèi)保持高效脫單能力。在制藥廢水治理方面具有很廣闊的應(yīng)用前景。