缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌高表達(dá)miR-208b的外泌體而調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞活化、遷移和鐵死亡

劉圣桂 宋風(fēng)榮 別自東 鞏傳芬

山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬費(fèi)縣人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，臨沂 253400

逐漸有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體等一些細(xì)胞外囊泡能攜帶特異的RNA和蛋白而介導(dǎo)細(xì)胞和組織間的通訊，進(jìn)而參與調(diào)控多種重要的生物學(xué)事件，例如炎性反應(yīng)、腫瘤進(jìn)展、凋亡和鐵死亡等細(xì)胞死亡、血管生成和免疫應(yīng)答等，從而有可能成為疾病診斷的早期標(biāo)志物及靶向運(yùn)載藥物的重要載體［1-2］。近年來(lái)，有研究表明，心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞間也能通過(guò)外泌體等進(jìn)行信息交換，從而影響對(duì)方的生物學(xué)功能［3-4］。例如，心肌細(xì)胞在心肌梗死后能分泌大量的外泌體到血清和細(xì)胞間，從而影響疾病的生理病理過(guò)程［5］。目前，關(guān)于外泌體的研究已成為心臟疾病診治的研究熱點(diǎn)，但目前關(guān)于其中的作用機(jī)制的研究還不多。已有多項(xiàng)研究表明，各種外泌體中含有豐富的miRNAs，miR-208b就是其中一種［6-7］。miR-208b特異表達(dá)于心臟，且參與心肌肥厚、心肌梗死、心肌缺血、心肌纖維化及心力衰竭等多種心血管疾病的調(diào)控［7-9］。在多種心血管疾病發(fā)生的過(guò)程中，心肌組織均會(huì)分泌高表達(dá)miR-208b的外泌體，進(jìn)而影響其他細(xì)胞的生理過(guò)程，從而影響疾病的進(jìn)展過(guò)程［7-8］。但外泌體源性miR-208b是否能影響心肌成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能，目前研究甚少。另外，鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡模式，是鐵離子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）不斷生成累積而導(dǎo)致的［10］。目前有研究指出，鐵死亡在多種心血管疾病中發(fā)揮重要作用，且與成纖維細(xì)胞的活化關(guān)系密切［11-12］。但miR-208b是否也參與了鐵死亡的調(diào)控，目前還未有研究報(bào)道。本研究通過(guò)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌外泌體，探討外泌體源性miR-208b是否影響心肌成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能，將為心肌疾病的防治提供新思路和新靶點(diǎn)，同時(shí)為外泌體和其來(lái)源的miRNAs的臨床應(yīng)用提供更好的指導(dǎo)作用。

資料與方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧模型建立

人心肌細(xì)胞和人心肌成纖維細(xì)胞分別用含5%胎牛血清和雙抗的心肌細(xì)胞培養(yǎng)基和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基-2進(jìn)行培養(yǎng)。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-208b 抑制劑后培養(yǎng)于缺氧條件（含1%氧氣）12 h，然后復(fù)氧（正常培養(yǎng)條件）培養(yǎng)12 h。

2、外泌體分離和鑒定

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，在3 000×g下離心15 min，然后通過(guò)0.22 μm 膜過(guò)濾。用ExoQuick-TC 按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行分離外泌體，然后通過(guò)JEM-2100透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。同時(shí)，裂解外泌體并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，以檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101的表達(dá)。

3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光定量PCR（RT-qPCR）

根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)，使用Lipofectamine 2000 分別將50 nmol/L miR-208b 抑制劑、miR-208b mimics 和 miRNA 陰性對(duì)照（NC）轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。然后心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧或缺氧/復(fù)氧處理，心肌成纖維細(xì)胞加入正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞源性外泌體（N-Exo）、缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體（H/R-Exo）、鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin（10 μmol/L）或Erastin加H/R-Exo 進(jìn)行共培養(yǎng)。用miRNeasy Mini Kit 試劑盒提取心肌細(xì)胞、外泌體和心肌成纖維細(xì)胞的總RNA，接著用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、oligo（dT）和 random primer（或 miR-208b stem-loop RT primer）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green qPCR SuperMix 通過(guò) qRT-PCR 測(cè)定 RNA 表達(dá)水平。U6 和 GAPDH 被用作 miRNA 和 mRNA 的內(nèi)部對(duì)照，相對(duì)表達(dá)水平通過(guò) 2-ΔΔCt值計(jì)算。

4、外泌體攝取檢測(cè)

在 37 ℃下用2 μl CellTracker CM-DiI 標(biāo)記外泌體1 h，用ExoQuick-TC 沉淀DiI 標(biāo)記的外泌體，然后添加到心肌成纖維細(xì)胞中進(jìn)行共培養(yǎng)12 h。之后，固定并洗滌心肌成纖維細(xì)胞，并加入核染色（DAPI）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色10 min。最后，使用熒光顯微鏡觀察心肌成纖維細(xì)胞。

5、Western blot實(shí)驗(yàn)

使用含蛋白酶抑制劑的RIPA buffer 從心肌細(xì)胞、外泌體和心肌成纖維細(xì)胞中提取總蛋白。使用8% SDS-PAGE分離等量的每個(gè)蛋白樣品，并將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用CD63、TSG101、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）或β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗和辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。最后，使用BeyoECL Plus顯示印跡信號(hào)。

6、細(xì)胞存活力檢測(cè)

心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活力。每孔中加入10μl CCK-8 溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm的吸光度。

7、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

收集心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，用human pro-collagen Ⅰ alpha 1 DuoSet ELISA kit 和 human collagenⅢELISA kit 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的濃度。

8、Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移

將200 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基（含2×105個(gè)心肌成纖維細(xì)胞）接種到上室，下室加入含2.5%胎牛血清的培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱8 h后，遷移細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，接著用結(jié)晶紫染色10 min。最后，選擇5 個(gè)隨機(jī)區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，評(píng)估細(xì)胞遷移水平。

9、脂質(zhì)過(guò)氧化和Fe2+檢測(cè)

使用ROS assay kit 分析細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，先將心肌成纖維細(xì)胞與 10 μmol/L ROS 熒光探針 DCFH-DA 于 37 ℃避光孵育20 min，然后用熒光分光度計(jì)在488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm 發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所示，使用lipid peroxidation MDA assay kit 檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞裂解物中丙二醛（malonaldehyde，MDA）的含量。用iron assay kit檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞中Fe2+水平。

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的顯著性分析使用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌高表達(dá)miR-208b 的外泌體

對(duì)心肌細(xì)胞的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其能分泌外泌體（圖1A），且外泌體顯著表達(dá)相關(guān)的標(biāo)志物（圖1B）。缺氧和缺氧/復(fù)氧（H/R）均能促進(jìn)miR-208b 在心肌細(xì)胞中的表達(dá)，且H/R 的促表達(dá)效果更顯著（圖1C）。檢測(cè)心肌細(xì)胞所分泌外泌體中miR-208b 的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)，缺氧和H/R 顯著促進(jìn)外泌體中miR-208b 的表達(dá)，且 H/R-Exo 中 miR-208b 的表達(dá)水平更高（圖1D）。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-208b 抑制劑后，外泌體中miR-208b的表達(dá)顯著減少（圖1C、D）。這表明，缺氧能促進(jìn)miR-208b 在心肌細(xì)胞和其分泌外泌體中的表達(dá)，且H/R 進(jìn)一步增強(qiáng)上述效果。不過(guò)心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行缺氧和H/R處理時(shí)，miR-208b 在細(xì)胞中的表達(dá)變化不明顯（圖1E），表明缺氧和H/R 不影響miR-208b 在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。

圖1 缺氧/復(fù)氧促進(jìn)心肌細(xì)胞和其分泌外泌體高表達(dá)miR-208b。A：電鏡觀察心肌細(xì)胞所分泌外泌體；B：Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101的表達(dá)水平；C～D：心肌細(xì)胞培養(yǎng)于缺氧條件（Hypoxia，含1%氧氣）12 h后，復(fù)氧（Reoxygenation，正常培養(yǎng)條件）培養(yǎng)12 h，或轉(zhuǎn)染miR-208b抑制劑后再進(jìn)行H 或H/R 處理，接著用熒光定量PCR 檢測(cè)心肌細(xì)胞（C）和其分泌外泌體（D）中miR-208b的表達(dá)水平，NC為miRNA 陰性對(duì)照；E：心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行缺氧或缺氧/復(fù)氧處理，然后用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-208b的表達(dá)水平

2、H/R-Exo 通過(guò)miR-208b 促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的存活和遷移

將H/R-Exo 加入到心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，可明顯觀察到心肌成纖維細(xì)胞攝入外泌體（圖2A）。同時(shí)，H/R-Exo 顯著增加miR-208b 在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，而N-Exo無(wú)此作用（圖2B）。H/R-Exo 明顯促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的存活力，而抑制miR-208b 表達(dá)時(shí)，H/R-Exo 促細(xì)胞存活的作用顯著被減少，且N-Exo 無(wú)法促進(jìn)細(xì)胞存活力（圖2C）。同時(shí)對(duì)細(xì)胞遷移的檢測(cè)表明，H/R-Exo 顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移，miR-208b 的抑制物能減弱上述外泌體的促遷移作用；而N-Exo對(duì)細(xì)胞的遷移無(wú)影響（圖2D～E）。這表明H/R心肌細(xì)胞所分泌外泌體通過(guò)高表達(dá)的miR-208b 促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的存活和遷移。

圖2 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞源性外泌體（H/R-Exo）通過(guò)miR-208b 促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞存活和遷移。A：H/R-Exo 用熒光染料DiI 標(biāo)記后加入到心肌成纖維細(xì)胞（CFs）中進(jìn)行共培養(yǎng)，然后熒光顯微鏡觀察CFs 攝取外泌體，DAPI 為核染色；B～D：CFs 分別加入正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞源性外泌體（N-Exo）和H/R-Exo，或轉(zhuǎn)染miR-208b 抑制劑后再加入H/R-Exo 進(jìn)行共培養(yǎng)；B：熒光定量PCR 檢測(cè)miR-208b的表達(dá)水平；C：細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞存活力，D～E：Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移

3、H/R-Exo 通過(guò)miR-208b 增強(qiáng)心肌成纖維細(xì)胞的活化

另 外 ，H/R-Exo 顯 著 增 強(qiáng) α -SMA、Collagen Ⅰ 和Collagen Ⅲ的mRNA 表達(dá)水平（圖3A～C），并促進(jìn)α-SMA的蛋白表達(dá)（圖3D），增加Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的分泌水平（圖3E～F），而N-Exo 無(wú)此作用。轉(zhuǎn)染miR-208b 抑制劑的心肌成纖維細(xì)胞與H/R-Exo 共培養(yǎng)時(shí)，H/R-Exo 促進(jìn)α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達(dá)的作用顯著被減弱（圖3）。因此，H/R-Exo 通過(guò)攜帶高水平的miR-208b 而促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的活化。

圖3 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞源性外泌體（H/R-Exo）通過(guò)miR-208b 增強(qiáng)心肌成纖維細(xì)胞（CFs）的活化。CFs 分別加入正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞源性外泌體（N-Exo）和H/R-Exo，或轉(zhuǎn)染miR-208b抑制劑后再加入H/R-Exo 進(jìn)行共培養(yǎng)。熒光定量PCR 檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）（A）、Collagen Ⅰ（B）和Collagen Ⅲ（C）的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)α-SMA 的蛋白表達(dá)水平（D），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)Collagen Ⅰ（E）和Collagen Ⅲ（F）的分泌水平

4、H/R-Exo 通過(guò)miR-208b 增加心肌成纖維細(xì)胞的鐵死亡水平

最新的研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡，一種新的細(xì)胞死亡方式，參與了成纖維細(xì)胞的活化過(guò)程［12］。因此，研究繼續(xù)探討H/R-Exo 所含miR-208b 是否與鐵死亡相關(guān)。用鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 處理心肌成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，鐵死亡的主要指標(biāo)ROS、MDA 和Fe2+的含量顯著增加（圖4A～C），而調(diào)控鐵死亡進(jìn)程的關(guān)鍵因子GPX4的表達(dá)明顯下調(diào)（圖4D～E），表明細(xì)胞的鐵死亡水平增加。同時(shí)加入Erastin 和H/R-Exo 時(shí)，ROS、MDA 和 Fe2+的累積進(jìn)一步增強(qiáng)（圖 4A～C），而GPX4 的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)（圖4D～E）。心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-208b抑制劑后再加入Erastin 和H/R-Exo 時(shí)，上述鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的變化水平顯著低于Erastin 和H/R-Exo（Erastin+H/R-Exo）處理組（圖4）。另外，miR-208b mimics也能增加ROS、MDA 和Fe2+的含量（圖4），表明miR-208b 能促進(jìn)鐵死亡發(fā)生。因此，H/R-Exo 可通過(guò)攜帶高水平的miR-208b而增強(qiáng)心肌成纖維細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)程。

圖4 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞源性外泌體（H/R-Exo）通過(guò)miR-208b 誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞（CFs）的鐵死亡發(fā)生。CFs 分別加入鐵死亡誘導(dǎo)劑 Erastin、Erastin 和 H/R-Exo、Erastin 加 H/R-Exo 和miR-208b 抑制劑、miR-208b mimics。用活性氧（ROS）熒光探針 DCFH-DA 檢測(cè)ROS 生成量（A），用脂質(zhì)過(guò)氧化丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MDA 的產(chǎn)生（B），用鐵測(cè)定試劑盒測(cè)量Fe2+的含量（C），熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）的表達(dá)水平（D、E）

討 論

多種心臟病均會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化，而纖維化的出現(xiàn)是決定心血管病預(yù)后的重要因素，會(huì)導(dǎo)致心律失常、心力衰竭甚至猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥［13］。因此，了解清楚心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制將有助于心臟疾病的預(yù)防治療，并可能找到合適的治療靶點(diǎn)。

逐漸有研究發(fā)現(xiàn)，在心肌疾病發(fā)生的過(guò)程中，不同細(xì)胞間可以通過(guò)外泌體等進(jìn)行信息交流，從而影響疾病的進(jìn)展過(guò)程［14］。例如，Luo 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理可上調(diào)心肌成纖維細(xì)胞所分泌外泌體/微囊泡中miR-423-3p 的表達(dá)，進(jìn)而這些外泌體/微囊泡通過(guò)miR-423-3p 靶向下游效應(yīng)器RAP2C而在缺血再灌注損傷急性期發(fā)揮心臟保護(hù)作用。血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）會(huì)誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞釋放外泌體，進(jìn)而通過(guò)激活A(yù)kt 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路而增加心肌細(xì)胞中Ang Ⅱ的產(chǎn)生及其受體的表達(dá)，從而加劇Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大［16］。本研究則發(fā)現(xiàn)，缺氧和缺氧/復(fù)氧均可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌高表達(dá)miR-208b 的外泌體。Wang 等［17］研究表明，缺氧會(huì)導(dǎo)致 H9c2 細(xì)胞分泌高表達(dá)miR-208a/b 的細(xì)胞外小泡，而這些細(xì)胞外小泡會(huì)通過(guò)miR-208a/b 而靶向抑制 RNA 結(jié)合蛋白抖動(dòng)（QKI）的表達(dá)，從而加劇缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，H/R-Exo 明顯促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的存活力和遷移，增強(qiáng)α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達(dá)，而miR-208b 的抑制物能顯著減弱上述外泌體對(duì)心肌成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響作用。因此，心肌細(xì)胞外泌體源性miR-208b在心肌疾病中具有重要意義。

本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，用鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 處理心肌成纖維細(xì)胞時(shí)，H/R-Exo 能進(jìn)一步增強(qiáng)鐵死亡主要指標(biāo)ROS、MDA 和Fe2+的累積，抑制鐵死亡關(guān)鍵調(diào)控因子GPX4 的表達(dá)；miR-208b 的抑制物能明顯減弱Erastin 和H/R-Exo 對(duì)鐵死亡的影響作用，并且miR-208b mimics 具有誘發(fā)鐵死亡發(fā)生的作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)，H/R-Exo 能通過(guò)miR-208a/b而影響心肌成纖維細(xì)胞的鐵死亡。而逐漸有研究表明，鐵死亡能影響成纖維細(xì)胞的活化［18-19］。例如，長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ZFAS1 在博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）處理的HFL1 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可通過(guò)miR-150-5p/SLC38A1軸而誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生，從而促進(jìn)TGF-β1 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化、炎癥和脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)BLM 誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和肺纖維化進(jìn)展［18］。而在缺血再灌注（I/R）大鼠模型和Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞模型中，miR-375-3p 通過(guò)抑制GPX4 的表達(dá)而加速心肌細(xì)胞的鐵死亡，從而促進(jìn)纖維化；miR-375-3p拮抗劑（或抑制劑）和Fer-1 促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的抗氧化能力，減少GPX4介導(dǎo)的鐵死亡過(guò)程，減輕I/R誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞活化［19］。另外，MLK3主要調(diào)節(jié)鐵死亡導(dǎo)致的慢性心力衰竭晚期心肌纖維化和JNK/p53 信號(hào)通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)壓力超負(fù)荷引起的不良心肌纖維化［20］。上述研究均表明，鐵死亡能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化，表明鐵死亡是纖維化疾病的一個(gè)重要誘因。

綜合上述，H/R-Exo 能通過(guò)高表達(dá)的miR-208b 而調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞的存活力、遷移、活化和鐵死亡等生物學(xué)功能，表明外泌體源性miR-208b 具有重要的功能，可能是心肌疾病密切相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突