907例復溫臍血造血干細胞質量的分析

錢坤，賀雪萍，王立業，韓俊領

協和干細胞基因工程有限公司(天津 300384)

臍血造血干細胞(Hemopoieticstemcells，HSCs)有著自我更新和多向分化的生物學功能。臍血作為一種珍貴的生物資源，已成為異基因造血干細胞移植中一個重要的干細胞來源，被越來越廣泛地應用于兒童及成人的惡性和非惡性血液病的治療[1]。世界范圍內臍血庫凍存臍血超過600000份備用查詢[2]。臍血供體的選擇通常以HLA匹配和有核細胞總數(totalnucleatedcells，TNC)為主要依據，CD34+細胞總數和總集落形成單位(colony-formingunits,CFU)也是評估造血潛能的重要參數。臍血冷凍和復溫過程會對HSCs質量產生影響[3]。本研究分析大量復溫臍血HSCs的檢測數據，旨在探究深低溫凍存和復溫過程對臍血HSCs生物學功能的影響程度，從而為臨床應用前對臍血質量的評估提供更有力的依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臍帶血的采集 分析天津臍帶血造血干細胞庫2018至2020年度907份復溫臍血樣本。臍血采集的對象為經篩選合格且志愿捐獻的足月正常分娩者，臍血采集前均經產婦本人同意并簽署《臍帶血捐獻知情同意書》。嬰兒娩出斷臍后即從靜脈穿刺抽取臍血注入含有枸櫞酸磷酸鹽抗凝劑的采血袋中混勻，于24小時內進行分離處理。

1.1.2 主要試劑與儀器 流式細胞儀；CO2恒溫培養箱；程控降溫儀；血細胞分析儀。甲基纖維素培養基；CD34-PE；mouse IgG1-PE；CD45-FITC；7-AAD；6%羥乙基淀粉；Cryosure-DEX40細胞凍存液。

1.2 方法

1.2.1 臍血的分離與冷凍 按照本臍血庫標準操作規程，將羥乙基淀粉與每份臍血以1∶4的比例充分混勻，經二次沉淀分離法制備富含有核細胞的血漿，再與細胞凍存液以4∶1比例在冰水浴中充分混勻，轉移至冷凍袋，經程控降溫儀降溫至-80℃后保存于-196℃液相液氮罐中。

1.2.2 臍血的復溫 將待復溫臍血的預留檢測辮管從液氮罐中取出在37℃～42℃的水浴中快速混勻融化，融化后立即抽取2mL樣本進行各項檢測。

1.2.3 復溫臍血的檢測 應用血細胞分析儀檢測白細胞(Whitebloodcell，WBC)，根據TNC=WBC×體積(L)計算TNC。應用甲基纖維素培養基檢測CFU，將臍血標本經溶血、洗滌處理后制備成細胞懸液，以1×105/mL的濃度接種于24孔板內,放置于CO2恒溫培養箱中，CO2濃度5%，濕度100%的條件培養14天，用倒置顯微鏡計數集落形成單位。根據CFU=集落形成單位計數/1×105×TNC計算CFU。按照血液病治療與移植國際聯合會(InternationalSocietyofHematotherapyandGraftEngineering，ISHAGE)方案檢測出有核細胞活率、CD34+細胞活率、CD34+細胞百分率。以CD45-FITC、CD34-PE、7-ADD標記樣本，IgG1-PE作為同型對照，應用流式細胞儀收集75000個有核細胞，分別圈選出CD34+細胞群(即CD34+，CD45dim+，7-AAD-，lowSSC，FSC與淋巴細胞相似)和有核細胞群(CD45+，7-AAD-)，并用CellQuest pro軟件計算出有核細胞活率、CD34+細胞(HSCs)活率、CD34+細胞百分率。

1.3 統計學處理

應用SPSS Statistics 23軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，相關數據的離散程度以變異系數CV表示，凍存前后計量資料的比較采用Wilcoxon秩和檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 復溫臍帶血基本情況

907份臍血平均凍存時間為(55.26±35.19)個月；TNC凍前為(11.14±3.31)×108，復溫后為(9.67±2.89)×108，回收率為(86.86±5.99)%，變異系數CV值為6.90%；CD34+細胞總數凍前為(32.29±22.98)×105，復溫后為(37.58±27.48)×105，回收率為(120.74±36.32)%，CV值為30.08%；CFU凍前為(9.86±3.83)×105，復溫后為(9.08±4.42)×105，回收率為(96.31±40.82)%，CV值為42.38%；復溫后有核細胞活率為(91.33±4.02)%，復溫后HSCs活率為(98.86±0.13)%。見表1。

表1 復溫臍帶血基本情況

2.2 復溫臍帶血各檢測項目凍存前后的差異性分析

907份臍血復溫后TNC比凍存前顯著減少(Z=26.09，P<0.01)；CD34+細胞總數比凍存前增加的有619例，減少的有288例，與凍存前有顯著差異(Z=12.63，P<0.01)；CFU比凍存前增加的有372例，減少的有535例，與凍存前有顯著差異(Z=6.34，P<0.01)。見表2。

表2 復溫臍帶血各檢測項目凍存前后差異性分析

3 討論

臍血存儲技術在我國發展已有20余年，逐級程控降溫、冷凍保護劑的使用、凍存溫度的控制以及復溫過程的技術已經比較成熟。細胞凍存采用甘油或二甲基亞砜作為保護劑，提高細胞膜對水的通透性；程控降溫技術使細胞內水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成；復溫時快速融化的方法也可以保證細胞外結晶在很短的時間內融化，最大程度避免對細胞的損傷。但HSCs仍因凍存、復溫過程和延長儲存時間等因素而受到損害[4]。由于臍血中細胞免疫原性較低，HLA配型成功率高，臨床篩選臍血時，多以凍存前的各項檢測數據評估臍血的質量。但凍存前的檢測數據是否能真實反映復溫后HSCs的生物學功能呢？

在本研究中，復溫后TNC的回收率為(86.86±5.99)%，與凍存前相比顯著下降(Z=26.09，P<0.01)，表明凍存和復溫的過程會導致部分臍血細胞死亡。復溫后有核細胞活率為(91.33±4.02)%，CD34+細胞活率為(98.86±0.13)%，顯著高于有核細胞活率。證明了非HSCs的有核細胞受凍存復溫的影響大于HSCs。賀雪萍等[5]通過比較雙平臺ISHAGE法和單平臺絕對計數法發現低溫凍存后有核細胞的組分會發生變化，中性粒細胞明顯下降，CD34+細胞占比有核細胞比例比冷凍前出現升高趨勢，導致計算出的CD34+細胞的百分數、總數和回收率較凍存前升高。這也解釋了本研究中復溫后CD34+細胞總數與凍存前相比有顯著差異(Z=12.63，P<0.01)的原因。

HSCs的生物學功能包括自我更新和多向分化。在體外培養的環境下，在半固體培養基上生長的CFU是由造血干(祖)細胞分化而來，因此CFU檢測能夠評估臍血中HSCs生物學功能。本研究中復溫后的CFU與凍存前相比有顯著差異(Z=6.34，P<0.01)，CFU回收率為(96.31±40.81)%，變異系數CV為42.38%，數據離散程度很大，表明CFU受凍存復溫過程的影響程度呈現個體差異，不具有一致性，與凍前相比減少的有535例，表明近60%的復溫HSCs樣本生物學功能有不同程度的減弱，我們推測這種差異的產生和新生兒的自身免疫力有著相關性。

綜上所述，臍血作為HSCs的重要資源，深低溫凍存和復溫技術日益發展，但仍對臍血中的細胞有一定程度損傷，對HSCs損傷已經降至很低的程度，未受損傷的HSCs的增殖分化生物學功能也有著不同程度的降低。復溫后各檢測數據與凍前相比均有顯著差異，臨床應用前對臍血的質量評估應以復溫后的檢測數據為主要依據。同時建議各地臍血庫應建立臍血捐獻者的健康隨訪檔案，關注捐獻者的健康狀況，這樣做一方面可以進一步開展影響HSCs生物學功能相關性的研究，另一方面可以對配型合格的臍血進行全面的干細胞數量和質量評估，為臨床評估干細胞移植效果提供更有力的依據。