西藏大花紅景天RcCATs與RcSODs基因克隆及功能分析

王宏鵬， 李一丹， 滕彥嬌， 陳成彬， 張力鵬

(南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

大花紅景天()是一種多年生草本植物，為景天科(Crassulaceae)紅景天屬()，主要分布于我國的青藏高原及其毗鄰一帶，包括西藏、云南和四川等地。中國藥典記載大花紅景天干燥根及根莖中含有多種活性成分，如紅景天苷、酪醇及其衍生物，具有益氣活血，通脈平喘的功能。現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究證明，大花紅景天根部浸出液能夠保護神經(jīng)，治療抑郁、焦慮和癌癥等多種疾病(Qu et al., 2012; Yuan et al., 2020)。但是，因其常伴有寒冷、低氧、強紫外照射等環(huán)境特點，主要分布于海拔3 500 ～5 000 m的山坡草地和大塊石灰?guī)r的縫隙中，生長環(huán)境較為嚴酷，使得大花紅景天的采集和研究應(yīng)用都十分困難(Fu et al., 2017)。目前，分子生物學(xué)研究多集中于大花紅景天活性成分及其種質(zhì)資源多樣性研究，關(guān)于其生境適應(yīng)性的分子機制，尚缺乏豐富的報道(Ma et al., 2007; Gyorgy et al., 2009)。

為了進一步研究和基因家族的功能，本研究以西藏大花紅景天為材料，對ROS途徑中的CAT和SOD基因家族成員進行克隆，基于在線軟件和實時定量PCR對其生物信息學(xué)和特異性表達進行分析，并構(gòu)建和1的酵母表達載體與酵母雙雜交誘餌載體，分別進行酵母脅迫分析和篩選擬南芥酵母文庫中的互作蛋白，以揭示西藏大花紅景天對其高原惡劣環(huán)境適應(yīng)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究材料為西藏大花紅景天，于2015年7月采集自西藏地區(qū)米拉山山脈(海拔4 868.4 m、92.34° E、29.78° N)。經(jīng)南開大學(xué)宋文芹教授鑒定為景天科藥用植物大花紅景天。部分材料經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃；其余材料以葉片為外植體進行組織培養(yǎng)獲得無菌再生苗并進行后續(xù)實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因序列擴增、和基因序列來源于本實驗室已完成的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，基于拼接的unigene注釋信息，分別以CAT和SOD為關(guān)鍵詞對數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得、和序列，然后根據(jù)所獲得的基因序列設(shè)計特異性引物擴增全長，以大花紅景天葉片cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后與pMD19-T vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在氨芐抗性平板上進行篩選，經(jīng)菌液PCR和電泳檢測后，挑選陽性克隆送上海生工測序。

1.2.2 總RNA提取與cDNA第一條鏈的合成 總RNA提取依照改良CTAB-異丙醇法進行(張力鵬等, 2017)。利用可見光分光光度計NanoDrop 1 000檢測RNA的純度和濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。cDNA第一條的合成利用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Takara, Japan)，采用50 μL體系，反轉(zhuǎn)錄總RNA量為5 μg RNA。將反轉(zhuǎn)產(chǎn)物用無菌dd HO稀釋10倍后-20 ℃保存。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過生物信息學(xué)在線網(wǎng)站對獲得的、和基因氨基酸序列進行分析。利用Blastx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blastx)進行序列驗證；利用ORF Finder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)獲得編碼框；利用BlastP尋找同源基因(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)；利用DNAMAN計算、和與各自同源基因的同源性比值；利用ProtComp分析基因的亞細胞位置(http://linux1.softberry.com/)；利用TMHMM Server, v. 2.0分析基因的跨膜結(jié)構(gòu)域有無(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；利用ExPASy預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)(https://web.expasy.org/protparam/) (張世鑫等, 2021; 解盛等, 2021)。

1.2.4 基因表達分析 組織特異性表達分析，采用同一株組培苗的根、莖、葉三個器官。非生物脅迫采用低溫誘導(dǎo)，將處于同一生長時期的組培苗浸于冰水混合物中黑暗脅迫處理0、3、7 d。植物激素脫落酸(ABA)誘導(dǎo)，將同一生長時期的組培苗浸于含有50 μmol·LABA的MS液體培養(yǎng)基中，黑暗處理6、24、36 h，每個處理均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。脅迫處理后，所有材料均經(jīng)無菌水洗凈并擦干后于液氮速凍，-80 ℃超低溫保存。脅迫處理材料的葉片用于提取總RNA(張力鵬等, 2019)。

1.2.5 實時定量PCR 采用Bio-Rad公司熒光定量PCR儀iQ5進行qRT-PCR，檢測目的基因在不同組織和不同脅迫條件下表達水平。反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL SYBRGreen(Takara, Japan)，1 μL cDNA，0.5 μL上下游引物。以為內(nèi)參基因，每個樣品均采用三次生物學(xué)重復(fù)(Zhang et al., 2018)。

1.2.6 酵母表達載體構(gòu)建和脅迫分析 利用無縫克隆法構(gòu)建大花紅景天和1的pYES2.0表達載體，大腸桿菌陽性克隆經(jīng)菌液PCR和Sanger測序驗證。將空載質(zhì)粒、重組載體質(zhì)粒按照LiTE/PEG法轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVSCI中。分別取INVSCI(pYES2.0、pYES2.0-、pYES2.0-1)單克隆于20 mL含2%葡萄糖的SC/-Ura液體培養(yǎng)基中，30 ℃/180 r·min培養(yǎng)至OD600位于0.5～0.8之間。收集菌體重懸于含2%半乳糖的SC/-Ura液體培養(yǎng)基中，調(diào)整OD600=2.0，30 ℃/180 r·min誘導(dǎo)24 h。將誘導(dǎo)后的陽性菌株按照10倍梯度稀釋，取6 μL分別滴于不同YPDA平板中進行脅迫處理。脅迫條件為熱脅迫(37 ℃處理1 d)、冷脅迫(-20 ℃處理6 h)、過氧化氫脅迫(YPDA平板中加入0.8、1.6、3.2 mmol·LHO)、鹽脅迫(YPDA平板中加入200、400、600 mmol·LNaCl)、重金屬和堿脅迫(平板中加入5、10 mmol·LCoCl或20 mmol·LNaCO)。將上述平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后拍照(Wang et al., 2008)。

1.2.7和1自激活鑒定與互作蛋白篩選 酵母雙雜交篩選擬南芥文庫依Clontech公司Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual說明書進行。構(gòu)建和1基因的誘餌載體，通過LiTE/PEG法轉(zhuǎn)化Y2H Gold菌株；經(jīng)菌液PCR驗證陽性菌并進行自激活和毒性驗證，以排除基因本身對雜交結(jié)果的影響；進行文庫篩選，將誘餌載體與文庫混合后涂布于SD/-Trp-Leu-His+β-gal培養(yǎng)基進行初篩，挑選藍斑菌落搖菌提取質(zhì)粒；利用T7/3’AD進行擴增和測序，根據(jù)測序結(jié)果確定基因；將比對后的陽性克隆，正對照pGBKT7-53+pGADT7-T，負對照pGBKT7-(1)+pGADT7分別滴于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu+β-gal培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d后拍照(Zhang et al., 2018)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花紅景天RcCATs和RcSODs基因的鑒定與克隆

因大花紅景天沒有參考基因組信息，同時NCBI網(wǎng)站公布的有關(guān)紅景天屬基因序列多為DNA條形碼。因此，為解決其基因序列的缺乏，本實驗室對西藏大花紅景天進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過拼接技術(shù)獲得unigenes序列并進行功能注釋。最終得到2條編碼過氧化氫酶CAT的基因分別命名為和1，得到3條編碼超氧化物歧化酶SOD的基因分別命名為1、2、3，1條編碼超氧化物歧化酶的銅伴侶的基因。

根據(jù)各基因unigenes序列分別設(shè)計引物，以大花紅景天葉片cDNA為模板進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，和1基因長度均為1 479 bp，編碼為492個氨基酸，分子量稍有不同，RcCAT為56 701.04 Da，RcCAT1為56 818.29 Da。1和2基因編碼Cu/Zn SOD，核苷酸大小為471/669 bp，編碼156/222個氨基酸，分子量為16 070.12/21 870.7 Da；3基因編碼Fe SOD，核苷酸數(shù)量為804 bp，可編碼267個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為30 816.31 Da。基因大小為1 008 bp，編碼335個氨基酸。

圖 1 大花紅景天CAT、SOD、CCS基因PCR擴增電泳圖Fig. 1 PCR amplification electrophoresis result of CAT, SOD, CCS genes of Rhodiola crenulata

2.2 大花紅景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因生物信息學(xué)分析

對大花紅景天、和基因的氨基酸序列進行分析，通過在線BlastP比對，獲得NCBI數(shù)據(jù)庫中的同源基因，利用DNAMAN計算各自基因與其同源基因的序列相似度，并利用多個在線網(wǎng)站基于其氨基酸序列進行分析。結(jié)果顯示，6個基因與其同源基因的序列一致性在60%以上，基因最高(95.51%)，基因最低(66.37%)， 各自同源基因均為雙子葉植物， 且尚未下載到景天科紅景天屬的相關(guān)序列。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示1和3蛋白質(zhì)的等電點高于7.0，其余4個基因均為酸性蛋白質(zhì)，其中的等電點最低，為5.7。脂溶指數(shù)均在70%以上，其中1和2較高，分別為91.86和88.93，說明其為明顯的脂溶性蛋白?？偲骄H水性除2(0.085)外，其他均為負值，說明其具有一定的親水性。此外，對跨膜結(jié)構(gòu)域和其發(fā)揮生物學(xué)功能的主要亞細胞位置進行分析，結(jié)果顯示6個基因均無跨膜結(jié)構(gòu)域，定位于過氧化物酶體，1和2定位于細胞質(zhì)，3和定位于線粒體。蛋白激酶磷酸化位點預(yù)測結(jié)果顯示6個基因均具有可磷酸化氨基酸位點，說明其可能受到蛋白磷酸激酶的調(diào)控(表1)。利用MEGA7.0構(gòu)建和的N-J進化樹，結(jié)果顯示基因與棉花()的遺傳距離最近，而1與所列物種的CAT基因遺傳距離較遠。1與獼猴桃()最近，2與甜瓜()最近，3與西葫蘿()、苦瓜()遺傳距離最近(圖2)。

表 1 大花紅景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因序列信息Table 1 RcCATs, RcSODs and RcCCS gene sequence information in Rhodiola crenulata

圖 2 RcCATs和RcSODs基因的N-J進化樹Fig. 2 N-J phylogentic tree of RcCATs and RcSODs

2.3 RcCATs、RcSODs和RcCCS基因組織特異性表達模式

因不同基因發(fā)揮其分子功能的部位不同，基因常具有組織器官表達特異性。利用實時定量PCR方法檢測、和基因的mRNA在三個組織部位(根、莖、葉)的表達水平，可進一步了解各基因在大花紅景天生長周期內(nèi)所扮演的角色。結(jié)果顯示基因的兩個成員在不同組織的表達水平差異很大，相比于根組織，在葉片中表達量最高呈2.5倍的顯著差異，莖中的表達稍低，約為0.6左右；而1在葉片和莖中表達均較低，僅為根中的1/5?；虻谋磉_模式十分相似，即在根與莖中表達量相近而遠低于葉中的表達量，如1在葉片中表達量是根莖中的2倍，2可達4倍左右；3基因在葉片中超表達是根的6.7倍，莖的3.7倍?；虻谋磉_模式與2相似，在葉片中高表達是根/莖組織的3.5倍左右(圖3)。

A. 根; B. 葉; C. 莖。*表示顯著性差異(P<0.05); **表示極顯著性差異(P<0.01)。下同。A. Root; B. Leaf; C. Stem. * indicates significant differences (P<0.05); ** indicates extremely significant differences (P<0.01). The same below.圖 3 大花紅景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因組織特異性表達模式圖Fig. 3 Expression pattern graph of RcCATs, RcSODs and RcCCS tissue-specificity

2.4 冷脅迫與植物激素ABA誘導(dǎo)下RcCATs、RcSODs和RcCCS基因表達模式

大花紅景天生長的環(huán)境惡劣，主要表現(xiàn)為溫度較低，而低溫會降低呼吸作用和光合作用速率，同時誘發(fā)產(chǎn)生大量活性氧，以阻礙植物的生長發(fā)育。因此對大花紅景天組培苗進行了低溫脅迫處理，以進一步分析、和基因在低溫誘導(dǎo)下的表達模式變化。結(jié)果顯示基因隨著脅迫時間的延長表現(xiàn)出明顯的上調(diào)趨勢，尤其是的表達量較對照組提高2倍左右；相反3個基因的表達量呈下降趨勢，僅2在脅迫第7天時有微弱的上調(diào)趨勢，且與基因的表達模式一致。

植物內(nèi)源激素脫落酸(abscisic acid，ABA)作為一種廣泛應(yīng)答脅迫的信號，在調(diào)節(jié)植物體內(nèi)平衡以及提高脅迫耐受性方面發(fā)揮重要的作用，因此本研究繪制了大花紅景天、和基因在不同ABA處理時間下的表達譜。結(jié)果顯示的兩個成員表達變化完全不同，在脅迫24 h時下調(diào)表達相比于對照組下降5倍以上；1上調(diào)表達為對照組的6倍左右?；虻?個成員中，1隨ABA脅迫時間的延長而下調(diào)表達僅為對照組的40%，2和3表現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的趨勢。此外，基因的表達模式與2一致，即24 h下調(diào)表達，36 h上調(diào)表達(圖4)。

圖 4 大花紅景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因響應(yīng)低溫和ABA脅迫表達水平Fig. 4 Expression levels of RcCATs, RcSODs and RcCCS genes under cold and ABA treatment conditions by qRT-PCR

2.5 RcCAT和RcSOD1的酵母異源表達與脅迫分析

為進一步分析和基因在調(diào)節(jié)大花紅景天應(yīng)對高原惡劣環(huán)境時的生理意義，我們分別構(gòu)建了和1的pYES2.0重組載體，并轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株INVSCI中(圖5)。由圖5可知，在6種脅迫下，轉(zhuǎn)pYSE2.0空載的酵母菌株生長的數(shù)量、菌斑大小和生命能力均不如和1基因的陽性菌株。低溫處理6 h后，空載菌株已失去了生活能力，而對和1菌株影響較??；過氧化氫能夠明顯抑制酵母生長，空載菌株在1.6、3.2 mol·L時已基本失去了細胞活性，但異源表達和1的菌株仍可在細胞濃度較高時具備一定的生命能力；對于不同濃度的鹽脅迫而言，對空載菌株的影響非常大，而對和1菌株影響較小；同樣，重金屬和NaCO脅迫也對陽性菌株影響較低。

圖 5 過表達RcCAT和RcSOD1基因的酵母非生物脅迫誘導(dǎo)分析Fig. 5 Yeast abiotic stress induction analysis of RcCAT and RcSOD1 overexpressions

2.6 RcCAT和RcSOD1互作蛋白的篩選

為了進一步研究和基因的功能，分別對和1基因進行克隆，并篩選擬南芥文庫。首先驗證其自激活活性和細胞毒性。如圖6所示，轉(zhuǎn)化pGBKT7-和pGBKT7-1的酵母細胞均在SD/-Trp培養(yǎng)基上能正常生長，但在SD/-Trp-His培養(yǎng)基上無法生長，負對照pGBKT7在SD/-Trp-His培養(yǎng)基上無法生長，正對照在SD/-Trp-His培養(yǎng)基上正常生長，表明RcCAT和RcSOD1蛋白均沒有自主激活活性和細胞毒性。

圖 6 RcCAT和RcSOD1基因酵母自激活和毒性驗證Fig. 6 Transcription activity and toxicity detection of RcCAT and RcSOD1

通過擬南芥酵母文庫篩選和點對點滴板驗證，篩選到了4個與互作明顯的基因，分別為(AT3G19860)、2(AT2G23070)、4(AT5G50750)和1(AT3G08850)(圖7)；3個與1互作明顯的基因，分別是(AT5G11890)、2(AT1G52030)和8(AT4G00660)(圖8)。擬南芥文庫數(shù)據(jù)庫收錄的基因功能描述見表2。

圖 7 RcCAT互作蛋白驗證Fig. 7 Validation of interaction proteins for RcCAT

圖 8 RcSOD1互作蛋白驗證Fig. 8 Validation of interaction proteins for RcSOD1

表 2 RcCAT和RcSOD1基因互作基因信息Table 2 Interaction genes function information of RcCAT and RcSOD1

3 討論與結(jié)論

活性氧作為植物體內(nèi)源分子，一方面在正常條件下可由光合作用和呼吸作用中電子傳遞鏈產(chǎn)生；另一方面當外界環(huán)境發(fā)生改變時會引起生物膜系統(tǒng)或電子傳遞鏈的損傷，從而誘發(fā)產(chǎn)生大量ROS，對細胞造成氧化損傷，因此ROS作為信號分子可直接參與植物對脅迫的應(yīng)答。本研究中，共分離了ROS清除途徑中的2條CAT酶基因、3條SOD酶基因和1條SOD銅伴侶基因。組織表達特異性分析和亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明基因主要在葉片中大量表達，亞細胞位置定位于過氧化物酶體，并受到低溫脅迫誘導(dǎo)大量表達，這與羊茅1基因亞細胞定位于過氧化物酶體，其在冷處理的葉片中被顯著誘導(dǎo)(楊文龍等, 2006)以及表達小麥CAT基因的水稻提高了對低溫脅迫的應(yīng)答(Matsumura et al., 2002)等的研究結(jié)果一致。同時，F(xiàn)aCAT1是一種ⅰ型過氧化氫酶，有報道稱ⅰ型過氧化氫酶在葉片中高度表達并參與清除光呼吸中HO的去除(Willekens et al., 1995)。因此，基因可能共同參與了大花紅景天光呼吸作用和對外界脅迫的應(yīng)答。此外，2和基因在組織表達特異性、低溫或ABA脅迫誘導(dǎo)時的表達模式十分相近，推測可能特異性將銅離子傳遞給2，將其激活生成有活性的酶分子(Yamasaki et al., 2009)。經(jīng)同源序列比對，1和2雖均編碼Cu/Zn SOD，3編碼Fe SOD，但1在低溫下的表達模式與3相似，在ABA誘導(dǎo)下的表達模式與2有所差異。劉家林等人報道的水稻基因也存在類似的情況，即同一類型基因在同一逆境下的表達量也有所不同(劉家林等, 2018)，說明在大花紅景天體內(nèi)均可將超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫，但存在功能上的冗余和分歧。

通過構(gòu)建表達載體pYES2.0，將和1基因異源過表達于釀酒酵母菌株INVSCI中，并以空載質(zhì)粒作為對照，分析其在不同處理下細胞生長的水平，結(jié)果可見和1均可應(yīng)對冷、熱、鹽、堿、HO、重金屬等脅迫壓力，班巧英等(2008)將紫桿檉柳MnSOD基因轉(zhuǎn)入酵母，也提高了酵母抵抗鹽、堿和紫外線脅迫的能力。因此，推測兩個基因在大花紅景天體內(nèi)可能直接參與ROS分子的清除并協(xié)助其應(yīng)對復(fù)雜的外界環(huán)境，同時，進一步證實了CAT和SOD基因能夠廣泛參與植物的非生物脅迫以維持體內(nèi)ROS含量的平衡(陳金峰等, 2008; 劉家林等, 2018)。此外，酵母雙雜交也篩選到基因的互作基因如121，該基因為bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，在鐵元素缺乏時可引起磷酸化，繼而誘導(dǎo)HLH38/39/100/101基因表達，這些轉(zhuǎn)錄因子反過來與FIT二聚化驅(qū)動IRT1和FRO2的基因的轉(zhuǎn)錄以增加鐵的攝取(Lei et al., 2020)。另一互作基因2為質(zhì)體酪蛋白激酶2，是葉綠體基質(zhì)蛋白特異性Ser/Thr磷酸化酶，其活性可受到氧化還原信號調(diào)控，并可參與ABA調(diào)控擬南芥種子的萌發(fā)和幼苗的生長(Wang et al., 2014; Kim et al., 2016)。說明或1也可通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)植物的生長代謝網(wǎng)絡(luò)，但其調(diào)控機理仍需進一步研究。

大花紅景天的生長發(fā)育與抗逆基因的表達密切相關(guān)。本研究已對大花紅景天ROS途徑中2個關(guān)鍵基因和進行分離和分析。分析表明，大花紅景天的和基因家族在進化過程中發(fā)生了分化，并廣泛參與調(diào)控其生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)等代謝途徑。這種發(fā)現(xiàn)有利于了解大花紅景天應(yīng)對高原惡劣環(huán)境的適應(yīng)性，在隨后的研究中借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其生境適應(yīng)性機制進行深入研究，有望實現(xiàn)大花紅景天的人工引種馴化和規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化種植，同時提高研究人員對高原植物生長繁衍的認知。